家蚕核型多角体病毒BmNPV感染家蚕气管的研究

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家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)在感染家蚕的过程中,首先在中肠释放包涵体衍生型病毒(Occlusion-derived virus,ODV),进而侵染中肠上皮细胞并建立原发感染,随后有极性地从中肠上皮细胞的基膜侧出芽,形成出芽型病毒粒子(Budded virus,BV)。BV通过自身基因编码的蛋白触发宿主相关生理过程,使其从中肠逃逸,随后感染全身各个组织器官,建立系统性感染。在杆状病毒感染宿主并建立系统性感染的过程中,气管作为呼吸器官连接着全身各个组织,一直以来被认为发挥着重要的作用。为了深入了解BmNPV感染家蚕气管的特点以及分析气管在病毒传播中发挥的作用,本文运用免疫组织化学、转录组学、分子生物学、生物信息学等分析方法,研究了家蚕核型多角体病毒BmNPV感染家蚕后气管的组织病理学变化、病毒感染气管细胞的特点以及病毒感染后气管细胞的基因表达差异,主要结果如下:一、通过体视显微镜观察和HE染色,发现病毒感染后对家蚕气管组织的结构完整性产生剧烈的影响,包括组织解离、细胞肿胀、病毒DNA大量复制以及多角体在气管周边聚集等症状。二、利用重组荧光病毒并利用激光共聚焦显微镜追踪病毒感染进程发现,BmNPV在气管上呈线性传播,且气管末端分支的荧光在感染极晚期(72h)后会逐渐减弱,这一时间可以看到气管底端的荧光强度逐渐变强,这表明BmNPV在感染气管的过程中沿着气管末端分支逐渐向气管底端传播进而传播至全身其他组织器官,建立系统性感染。三、利用免疫荧光追踪野生型BmNPV感染家蚕后不同时相的进程,发现最早在感染后24h即可观察到气管上皮细胞的细胞核外有少量的荧光信号。随着时间地推移,在感染后48h,荧光信号清晰可见地分布在气管上皮细胞的细胞质中,且细胞体积变大,这证明气管上皮细胞是BmNPV感染的重要靶位点;荧光定量PCR结果证明气管细胞内会产生大量作用于细胞间感染的BV,这进一步证明了气管在病毒体内传播中的重要作用。四、通过转录组学测序分析病毒感染前后家蚕气管细胞的mRNA水平,结果表明,病毒感染后,DNA复制和氨酰tRNA合成、细胞骨架通路和糖蛋白合成相关基因表达整体呈上调趋势,能量代谢和免疫应答通路相关基因表达则整体呈下调趋势,这些差异表达基因可能与病毒在气管上皮细胞内的增殖、组装和传播等过程有关。
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