T-box转录因子是一种进化上高度保守的转录因子,它们从低等生物到高等生物中都普遍存在,并在多种组织器官中发挥着重要作用。基因tbx20与tbx1是T-box家族中的Tbx1亚家族的两个成员。tbx20在心脏发生,运动神经元细胞的迁移,四肢的发育,体节极性的维持等生长发育过程中扮演着重要的角色。tbx1对骨骼的正常发育,胸腺上皮细胞与大脑内皮细胞的增殖与分化,神经嵴细胞的正常迁移,第二心脏区域与血管细胞形态的维持有着重要的意义。虽然tbx20与tbx1的功能在小鼠与人类中研究较多,但在无脊椎动物,尤其是昆虫中的研究较少。家蚕作为一种典型的鳞翅目昆虫,是一种具有很大研究价值的模式生物,具有食源单一、易于饲养、结构简单、容易解剖、繁殖周期短、研究时间悠久、体积较大等特色,并且家蚕已完成基因组测序,对其研究提供了很大帮助。基因tbx20与tbx1在家蚕中的研究尚没有报道,因此,本研究对tbx20与tbx1在家蚕中的功能进行了初步探究。本研究克隆了家蚕tbx20与tbx1基因,利用抗体染色与进化分析等方法对其功能进行了初步研究。本研究对家蚕中tbx20与tbx1基因的功能探究打下基础,有利于人类相关疾病的防治。主要研究结果如下:(1)通过PCR方法,根据NCBI数据库中的预测序列设计引物,以蚁蚕cDNA为模板,通过STAR试剂盒扩增得到了家蚕tbx20与tbx1序列。在家蚕数据库中分析得知,Bmtbx20基因位于家蚕4号染色体上,含有3个外显子,2个内含子,CDS序列为1497bp,编码498个氨基酸,所编码的蛋白预测大小为55.77 KDa,等电点7.27。多序列比对与结构域分析表明,BmTbx20含有1个T-box结构域以及5个低复杂性结构域(LCRs),与人类相比多两个低复杂性结构域,而与果蝇相比少一个低复杂性结构域,应该是与进化程度有关。Bmtbx1基因位于家蚕16号染色体上,克隆得到的部分序列为915bp,编码305个氨基酸,所编码的蛋白预测大小为34.13 Kda,等电点8.29。与其他物种Tbx1蛋白结构相似,都含有1个T-box结构域。(2)使用BmTbx20与BmTbx1作为抗原,用来制备抗体。SDS-PAGE检测显示BmTbx20以包涵体形式存在,BmTbx1以可溶性蛋白形式存在。BmTbx20与BmTbx1重组蛋白经过纯化柱纯化之后,分别免疫兔子和小鼠制备多克隆抗体。酶联免疫吸附剂测定(ELISA)反应对抗体效价进行测定,抗体可以很好地与抗原发生特异免疫反应。(3)对家蚕胚胎进行组织抗体染色,结果显示:BmTbx20在家蚕胚胎的背血管,大脑与腹部神经索都有表达;而BmTbx1在家蚕胚胎的足部神经和大脑中表达明显高于其他组织。结果表明Bmtbx20和Bmtbx1都与大脑与神经的发育相关,且Bmtbx20在背血管的发育中发挥作用。(4)家蚕幼虫的组织染色显示,BmTbx20与BmTbx1在家蚕幼虫的气管与脂肪体共定位。通过DAPI染色显示,BmTbx20与BmTbx1都在细胞核中表达。说明Bmtbx20与Bmtbx1在气管和脂肪体的发育中共同发挥作用。(5)家蚕1龄至5龄幼虫的丝腺组织染色显示,BmTbx20在1-3龄的中部丝腺细胞质定位,4龄与5龄时期的中部丝腺细胞核定位;在3龄与4龄时期的后部丝腺细胞质定位,1龄、2龄以及5龄时期的后部丝腺细胞核定位。而BmTbx1在1-3龄以及5龄时期的中部与后部丝腺细胞质定位,4龄时期的中部与后部丝腺细胞核定位。说明Bmtbx20与Bmtbx1可能参与家蚕丝腺的发育。(6)从NCBI数据库中搜索收集其他物种的Tbx20与Tbx1的蛋白序列,使用MEGA5软件构建系统发生树。发生树分析表明BmTbx20与BmTbx1在进化上是非常保守的。分别先与昆虫类聚为一簇,再与其他无脊椎动物聚为一簇,最后与脊椎动物的蛋白序列聚为一簇。进化树的拓扑结构与物种树一致。