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目的:本研究拟以西瑞香素为指标,筛选优化瑞香狼毒最佳提取工艺,进而研究瑞香狼毒提取物对体外人肺腺癌A549细胞的作用及机制。材料与方法:以瑞香狼毒所含香豆素类化合物西瑞香素为指标,结合响应面分析法(Box-Behnken)利用HPLC进行最佳提取工艺研究。体外培养人肺腺癌A549细胞,采用MTT测定并筛选瑞香狼毒提取物(SCE)对人肺腺癌A549细胞最佳作用浓度;倒置显微镜观察细胞划痕实验SCE对人肺腺癌A549细胞生长抑制情况;通过激光共聚焦和荧光显微镜分别观察JC-1染色和Hoechst33342染色后不同SCE剂量组药物作用下人肺腺癌A549细胞线粒体膜电位和细胞凋亡情况;Western blot检测p53和MDM2蛋白的表达。结果:1.瑞香狼毒提取物(SCE)最佳提取工艺参数为:采用超声法提取,提取时间50 min,乙醇浓度90%,液料比7.5:1;二次回归模型方程:Y=185.96+17.17A-9.58B+0.70C+15.25AB+3.91AC-8.76BC+6.79A2-29.84B2-23.63C2,西瑞香素理论提取率为189.6μg/g;在此最优条件下,提取3批进行验证,平均提取率为188.55μg/g。2.MTT试验结果表明:SCE作用于人肺腺癌A549细胞后,在1ug/m L-20ug/m L浓度范围内,随着药物浓度的增加,细胞生长抑制率增强,呈现出良好的量-效关系。24h和48h半数抑制率IC50分别为37.5μg/ml和22.16μg/ml,综合药物溶解性和量-效关系选取10ug/m L浓度作为细胞作用最佳浓度。3.细胞划痕实验显示:SCE对人肺腺癌A549细胞生长抑制。24h细胞迁移率:对照组(24.39±1.21)高于加药组(19.51±1.23)(P<0.01);48h细胞迁移率:对照组(58.54±2.10)高于加药组(45.78±1.67)(P<0.01)。4.JC-1染色结果表明,不同剂量组SCE均具有不同程度的促线粒体凋亡作用,与正常组、低剂量相比,中剂量、高剂量和CCCP阳性组可观察到明显线粒体膜电位变化后的绿色荧光。5.Hoechst33342细胞凋亡试验显示,人肺腺癌A549细胞正常染色后呈淡蓝色,SCE作用后,从低剂量到高剂量组蓝色增强至逐渐呈亮白色,细胞凋亡后细胞核呈碎块状致密浓染或呈固缩状致密浓染。6.Western blot检测结果提示:与对照组比较,低、中、高剂量组p53表达有不同程度(P<0.05)上升;与低剂量和对照组比较,MDM2蛋白中、高剂量组表达显著下降(P<0.01)。结论:1.HPLC结合响应面优化分析所得西瑞香素含量测定结果可靠,色谱条件和检测方法稳定、可操作性强,重现性和回收率良好,回归模型实测值与理论值预期值拟合度较好,以西瑞香素得率为指标该提取工艺条件下所得瑞香狼毒提取物(SCE)可作为体外活性研究的样品。2.MTT实验结果表明瑞香狼毒提取物(SCE)在一定浓度范围内对人肺腺癌A549细胞有抑制作用,量效关系良好,抑制作用与药物浓度呈正相关。3.细胞划痕实验初步观察到瑞香狼毒提取物(SCE)对人肺腺癌A549细胞抑制作用。4.线粒体凋亡和Hoechst33342细胞凋亡结果表明,瑞香狼毒提取物(SCE)引起人肺腺癌A549细胞凋亡过程中,线粒体膜电位和细胞核、染色质均有不同程度的影响。5.瑞香狼毒提取物(SCE)体外作用于人肺腺癌A549细胞后,可能通过作用于p53-MDM2负反馈通路,发挥抑制A549细胞增殖的作用。