传统观点认为,肿瘤由均一的肿瘤细胞构成,所有肿瘤细胞具有相同的无限增殖能力。但近年来提出的肿瘤干细胞理论提出了全新的观点。该理论认为,肿瘤细胞具有异质性,只有极少数致瘤性细胞亚群具有自我复制、多向分化和无限增殖潜能,具有肿瘤始动能力及转移特性,在肿瘤中充当着干细胞的角色,能够启动肿瘤的形成和生长,大多数肿瘤细胞经过短暂的分化后都最终走向死亡。因这群细胞功能上与干细胞相似,故命名为肿瘤干细胞(tumor stem cell,TSC)。目前,白血病、乳腺癌、神经胶质瘤、前列腺癌等许多肿瘤组织中已成功分离出TSC,肿瘤研究已进入到TSC时代。越来越多的报道证明,肝癌干细胞确实存在,并可能成为根治肝癌的关键靶标。肝癌干细胞研究的难点在于确定其特异性表面标志物或标志物联合。关于标志物的研究,已陆续有实验发表:①肝SP细胞具有肝癌干细胞的生物学特性,其标志分子ABCG2可作为肝癌干细胞标记;②CD133不仅是乳腺癌、结肠癌和脑胶质瘤干细胞的表面标志物,也是肝癌干细胞的标志物;③CD90是肝癌干细胞高特异性标志物,在肝癌组织和外周血中有不同程度表达。总之,ABCG2、CD133和CD90,已成为当今肝癌干细胞标志物研究的核心。然而,肝癌干细胞的研究才刚刚起步,还有很多问题尚不清楚。肝癌干细胞在人的肝癌组织、外周血中存在和分布特点如何?与肝癌病情进展有无相关性?化疗耐药细胞与肝癌干细胞关系怎样?肝癌干细胞含量极低,如何才能筛选和富集?面对上述疑问,我们无法从当前的研究资料中寻找到答案!肝癌干细胞对化疗药物有普遍耐药性,现有的各种治疗措施无法针对肝癌干细胞发挥作用,肝癌干细胞的化疗逃逸可能是导致临床治疗失败、肝癌复发的主要原因。因此,探求肝癌干细胞的生物学特性,了解肝癌干细胞的化疗逃逸过程,对进一步开发针对于肝癌干细胞的靶向治疗至关重要。为此,本课题以目前肝癌干细胞表面标志物研究的最新进展为依据,以肝癌干细胞为立足点,分析人的肝癌组织、外周血中肝癌干细胞的存在、分布及与肝癌进展的关系,探讨常规化疗在体外对人肝癌干细胞的治疗反应,以期为肝癌干细胞的筛选富集和靶向治疗提供依据。目的:1.检测肝癌干细胞标志物CD133和CD90在原发性肝癌组织中的表达情况,分析其临床病理学意义。2.比较临床病理特征不同的肝癌患者外周静脉血CD45-CD133+、CD45-CD90+细胞百分数,探讨CD133、CD90阳性表达与肝癌进展的关系。3.研究常规化疗对人肝癌细胞中肝癌干细胞的治疗反应,寻找能够筛选和富集肝癌干细胞的新方法和新途径。方法:1.取93例肝细胞癌和10例正常肝组织,免疫组织化学S-P法检测CD133和CD90表达。2.采用流式细胞术检测65例原发性肝癌患者外周血CD45-CD133+细胞百分数,另采集20例健康体检者血样作为对照;采用流式细胞术检测49例原发性肝癌患者外周血CD45-CD90+细胞百分数,另采集10例健康体检者血样作为对照。3.采用阿霉素、氟尿嘧啶和顺铂血浆药物峰浓度体外联合化疗法连续6个周期处理原代培养的人肝癌细胞;免疫组织化学法检测化疗残存细胞(DSCs)的ABCG2和CD133表达;流式细胞术检测CD45-ABCG2+、CD45-CD133+细胞百分数;Western blot法检测ABCG2蛋白表达。结果:1. 93例肝癌组织中,71例CD133表达阳性,平均阳性细胞百分数为(6.4±3.3)%,64例CD90表达阳性,平均阳性细胞百分数为(4.3±3.9)%,10例正常肝组织中未见CD133和CD90阳性表达,差异有统计学意义(P<0.01);肝癌TNM分期Ⅲ、Ⅳ期患者CD133和CD90阳性细胞百分数[(8.1±3.7)%,(5.7±4.2)%]显著高于Ⅰ、Ⅱ期[(4.1±2.3)%,(2.3±1.9)%](P<0.01);Spearman相关性分析显示,随病理级别增高,CD133和CD90的表达增多[CD133:Ⅰ级(0.1±0.1)%、Ⅱ级(1.9±0.7)%、Ⅲ级(5.9±2.3)%、Ⅳ级(16.1±4.7)%;CD90:Ⅰ级(0.3±0.3)%、Ⅱ级(1.8±1.7)%、Ⅲ级(3.3±2.9)%、Ⅳ级(10.8±4.2)%](P<0.05);CD133表达与CD90表达之间有相关性,二者呈正相关(r=0.402,P<0.01)。2. 65例HCC患者外周血PBMC中CD45-CD133+细胞百分率为(2.0±1.3)%,20例正常对照未检出CD45-CD133+表达,差异有统计学意义(χ2=20.20,P<0.01);CD45-CD133+细胞含量与肿瘤包膜完整性(P<0.01)、门静脉癌栓(P<0.01)、TNM分期(P<0.01)显著相关,与肿瘤直径(P>0.05)、AFP值(P>0.05)无相关性;Spearman相关性分析显示,随病理组织分级增高,CD133的表达增多(P<0.01)。3. 49例HCC患者外周血PBMC中CD45-CD90+细胞百分率为(3.3±1.2)%,10例正常对照未检出CD45-CD90+表达,差异有统计学意义(χ2=33.55,P<0.01);CD45-CD90+细胞含量与肿瘤包膜完整性(P<0.01)、门静脉癌栓(P<0.01)、病理组织分级(P<0.01)显著相关,与肿瘤直径(P>0.05)、AFP值(P>0.05)无相关性;Spearman相关性分析显示,随TNM分期增高,CD90的表达增多(P<0.01)。4.联合化疗对肝癌细胞有明显抑制作用。免疫组化结果显示,对照组ABCG2阳性细胞百分率为(2.4±1.4)%;DSCs组ABCG2阳性率为(71.2±14.7)%,差异有统计学意义(χ2=1906.25,P<0.01);对照组CD133阳性细胞百分率为(3.3±1.7)%,DSCs组CD133阳性率为(94.5±13.8)%,差异有统计学意义(χ2=1664.29,P<0.01)。流式细胞仪检测结果显示,CD45-ABCG2+细胞在对照组的平均阳性率为(1.31±0.64)%,DSCs组的平均阳性率为(57.32±4.63)%,差异有统计学意义(χ2=756.94,P< 0.01);CD45- CD133+细胞在对照组的平均阳性率为( 2.03±0.96)%,DSCs组的平均阳性率为(87.63±7.29)%,差异有统计学意义(χ2=1481.50,P<0.01)。Western blot检测结果显示, DSCs组在相对分子质量为70 000 Da左右出现ABCG2蛋白阳性表达目的条带,与对照组相比,DSCs组的ABCG2蛋白表达显著增强,差异有统计学意义(P < 0.05)。结论:1.肝癌组织中存在CD133和CD90阳性肝癌干细胞,其表达量与肝癌TNM分期和病理组织学分级呈正相关。2.肝癌患者外周血中存在CD45-CD133+、CD45-CD90+肝癌干细胞,其百分数与肝癌进展密切相关,检测肝癌患者外周血CD45-CD133+、CD45-CD90+细胞百分数对估计有无血行播散和远处转移有临床实用价值。3.肝癌DSCs中ABCG2、CD133的阳性细胞百分数及ABCG2蛋白表达显著增加,提示常规联合化疗对肝癌干细胞没有杀伤作用。