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背景与目的骨肉瘤是青春期男性中多发的恶性骨肿瘤,它衍生于骨形成的间充质细胞,许多骨肉瘤患者被确诊时伴有转移性疾病,且多为肺转移。尽管目前骨肉瘤的治疗效果有所提升,但患者的预后仍不佳,特别是发生转移与复发的患者其生存率依然较差。因此,寻求开发高效和安全的骨肉瘤诊治的新的途径和策略十分必要。环状RNA（circular RNA,circRNA）是一种新型的内源性非编码RNA,具有闭环结构,可以调节线性RNA转录,下游基因表达和蛋白质的生成。CircRNA可通过海绵化微小RNA（micro RNA,miRNA）和调节miRNA靶基因的表达来充当转录调节因子在癌症生物学中起着不可或缺的作用。CircRNA还具有肿瘤抑制或致癌作用,导致癌症的抑制或进展,因此也可成为癌症诊断和治疗的潜在靶点。转录因子runt相关蛋白2（RUNX2）具有调节成骨细胞分化和致癌的潜力,已有文献报道RUNX2在人骨肉瘤组织中过表达,对骨肉瘤的发生和进展具有重要影响。依据前期骨肉瘤癌组织与癌旁组织的高通量测序结果提示hsa＿circ＿0006354在骨肉瘤组织中高表达。本研究拟利用生物信息学进行预测及实验验证hsa＿circ＿0006354可通过海绵化吸附与hsa-miR-647相互结合,且RUNX2是hsa-miR-647的靶基因。通过一系列分子与细胞生物学实验以探索骨肉瘤细胞中hsa＿circ＿0006354对hsa-miR-647和RUNX2表达的影响,探讨hsa＿circ＿0006354/hsa-miR-647/RUNX2调控轴存在的可能性及对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响和作用机制,以期为骨肉瘤诊断和治疗提供新的生物标志物和治疗靶点,为其在临床医学的应用提供理论支撑。方法1.筛选骨肉瘤组织中表达差异的circRNA,确定骨肉瘤细胞中hsa＿circ＿0006354环状结构的存在根据前期高通量测序结果,寻找在骨肉瘤组织与癌旁组织之间差异表达的circRNA（如hsa＿circ＿0006354）;提取骨肉瘤MG63的RNA,反转录得到cDNA为模板,利用circbase数据库设计hsa＿circ＿0006354的Divergent Primer引物,PCR扩增目的片段,sanger测序确定该circRNA的反向剪切位点序列,并于数据库进行匹配,证实hsa＿circ＿0006354在骨肉瘤细胞中呈环状。2.生信数据库预测及双荧光素酶验证hsa＿circ＿0006354可与hsa-miR-647结合,hsa-miR-647与RUNX2 3′UTR靶向结合CircRNA数据库circBase、circInteractome预测与hsa＿circ＿0006354可能结合的miRNA（如hsa-miR-647）;miRNA靶基因预测数据库target Scan、miRanda对hsa-miR-647靶基因进行预测（如RUNX2）。分别构建hsa＿circ＿0006354与RUNX23′UTR的野生型和突变型报告载体质粒（pmir GLO-hsa＿circ＿0006354 wild/mutant type、pmir GLO-RUNX2 3′UTR wild/mutant type）,双荧光素酶实验验证hsa＿circ＿0006354与hsa-miR-647,hsa-miR-647和RUNX2 3′UTR的结合关系。3.探究hsa＿circ＿0006354、hsa-miR-647、RUNX2在骨肉瘤细胞中的表达水平qRT-PCR检测正常人成骨细胞h FOB1.19与骨肉瘤细胞系（MG63、U2OS、OHS、G292）中hsa＿circ＿0006354、hsa-miR-647、RUNX2 mRNA的表达水平;Western blotting检测RUNX2的蛋白表达水平。4.探讨沉默骨肉瘤细胞中的hsa＿circ＿0006354对hsa-miR-647和RUNX2表达、细胞表型和裸鼠成瘤能力的影响设计并合成3对hsa＿circ＿0006354潜在siRNA（siRNA1、siRNA2、siRNA3）,分别转染MG63、U2OS,qRT-PCR检测敲低效率,挑选出敲低效果最显著的siRNA。将效果最佳的siRNA分别转染骨肉瘤细胞MG63和U2OS。分组为:Blank组（细胞只加转染试剂）、si-NC组（细胞转染hsa＿circ＿0006354 negative control）、si-circ组（细胞转染hsa＿circ＿0006354 siRNA）;使用qRT-PCR检测hsa-miR-647与RUNX2的mRNA表达,Western blotting检测RUNX2的蛋白表达;采用CCK-8、划痕实验、transwell等实验检测沉默hsa＿circ＿0006354后细胞增殖、迁移与侵袭能力的变化。选择hsa＿circ＿0006354 sh-RNA慢病毒感染MG63,构建稳定低表达hsa＿circ＿0006354的细胞系（sh-circ）与对照细胞系（sh-NC）,建立裸鼠移植瘤模型,监测肿瘤生长,免疫组化分析移植瘤Ki-67蛋白变化,使用qRT-PCR检测移植瘤中hsa＿circ＿0006354、hsa-miR-647与RUNX2的mRNA表达,Western blotting检测移植瘤中RUNX2的蛋白表达。5.探究过表达hsa-miR-647对骨肉瘤细胞中RUNX2表达、骨肉瘤细胞恶性表型的影响将hsa-miR-647 mimics分别转染骨肉瘤细胞MG63和U2OS。Blank组（细胞只加转染试剂）、miR-647-NC组（细胞转染hsa-miR-647 negative control）、miR-647mimics组（细胞转染hsa-miR-647 mimics）;用qRT-PCR与Western blotting检测RUNX2的表达情况;通过相关细胞表型实验检测过表达hsa-miR-647对细胞的增殖、迁移与侵袭的影响。6.回复实验证明hsa＿circ＿0006354/hsa-miR-647/RUNX2轴参与调控骨肉瘤细胞的增殖和侵袭为更充分地证明hsa＿circ＿0006354/hsa-miR-647/RUNX2轴参与调控骨肉瘤细胞的增殖和侵袭,进行了两组回复实验。（1）过表达RUNX2对敲低hsa＿circ＿0006354和过表达hsa-miR-647的细胞效应的回复作用,分组为:Blank组（只加转染试剂）、si-circ组（转染hsa＿circ＿0006354 siRNA）、miR-647 mimics组（转染hsa-miR-647 mimics）、si-circ+OE-RUNX2组（共转染hsa＿circ＿0006354siRNA与RUNX2过表达质粒p RP[Exp]-Puro-CMV＞h RUNX2）、miR-647 mimics+OE-RUNX2组（共转染hsa-miR-647 mimics与RUNX2过表达质粒p RP[Exp]-PuroCMV＞h RUNX2）;（2）抑制hsa-miR-647对敲低hsa＿circ＿0006354的细胞效应的回复作用,分组为:Blank组（只加转染试剂）,si-circ组（转染hsa＿circ＿0006354siRNA）,si-circ+miR-647 inhibitor组（共转染hsa＿circ＿0006354 siRNA与hsa-miR-647 inhibitor）。CCK-8与transwell实验检测转染后细胞的增殖与侵袭能力的变化。结果1.筛选获得了骨肉瘤组织与癌旁组织之间差异表达的hsa＿circ＿0006354,并证明该circRNA以环状结构在骨肉瘤细胞中真实存在前期高通量测序发现,对比癌旁组织,hsa＿circ＿0006354在骨肉瘤组织中高表达;Sanger测序结果与数据库中hsa＿circ＿0006354的剪切位点匹配,证明在骨肉瘤细胞中该circRNA以环状结构真实存在。将hsa＿circ＿0006354选为研究对象。2.预测并验证了hsa＿circ＿0006354可结合hsa-miR-647,hsa-miR-647与RUNX2 3′UTR靶向结合生信数据库预测结果表明,hsa＿circ＿0006354可结合hsa-miR-647,hsa-miR-647与RUNX2 3′UTR靶向结合;测序结果表明,hsa＿circ＿0006354与RUNX23′UTR的野生型和突变型报告载体质粒（pmir GLO-hsa＿circ＿0006354 wild/mutant type、pmir GLO-RUNX2 3′UTR wild/mutant type）构建成功;双荧光素酶结果显示,hsa＿circ＿0006354可与hsa-miR-647结合,hsa-miR-647可靶向结合RUNX2 3’UTR区域。3.实验证明了hsa＿circ＿0006354、hsa-miR-647、RUNX2在骨肉瘤细胞中的表达存在差异qRT-PCR结果显示,与人正常成骨细胞h FOB1.19比较,骨肉瘤细胞系（MG63、U2OS、OHS、G292）中hsa＿circ＿0006354与RUNX2高表达（P＜0.001,）,hsa-miR-647低表达（P＜0.001）。Western blotting结果显示RUNX2蛋白高表达（P＜0.001,P＜0.01）。4.沉默骨肉瘤细胞中的hsa＿circ＿0006354可上调hsa-miR-647表达、下调RUNX2的表达,抑制骨肉瘤细胞恶性表型及裸鼠成瘤能力siRNA1、siRNA2、siRNA3分别转染MG63、U2OS后,qRT-PCR检测后得到沉默效果最佳的siRNA为siRNA3（P＜0.001）,并选择siRNA3用于后续实验。hsa＿circ＿0006354 siRNA转染MG63与U2OS细胞,与Blank组和si-NC组比较,si-circ组中hsa＿circ＿0006354和RUNX2表达降低（P＜0.001,P＜0.01）,hsa-miR-647表达升高（P＜0.001）;MG63和U2OS细胞增殖、迁移和侵袭能力均被抑制（P＜0.001,P＜0.01）;裸鼠成瘤实验显示,沉默hsa＿circ＿0006354抑制了MG63细胞皮下成瘤能力,与sh-NC组比较,sh-circ组的瘤组织Ki-67蛋白表达减少（P＜0.01）,sh-circ组中hsa-miR-647表达升高（P＜0.01）,而hsa＿circ＿0006354、RUNX2 mRNA和蛋白水平均下降（P＜0.001）。结果提示,沉默hsa＿circ＿0006354,可使骨肉瘤细胞hsa-miR-647表达升高,RUNX2表达降低,体内外抑制骨肉瘤细胞的增殖能力、抑制骨肉瘤细胞的迁移与侵袭能力。5.过表达骨肉瘤细胞中的hsa-miR-647可抑制RUNX2的表达,影响细胞的增殖、迁移和侵袭能力hsa-miR-647 mimics转染MG63与U2OS细胞,与Blank组和miR-647-NC组比较,miR-647 mimics组中的hsa-miR-647表达显著升高（P＜0.001）,RUNX2的mRNA和蛋白表达均显著减少（P＜0.001）,miR-647 mimics组两株细胞的增殖、迁移与侵袭能力强度均减弱（P＜0.001,P＜0.01）。综上表明,上调hsa-miR-647和下调hsa＿circ＿0006354的结果趋势一致,均可降低RUNX2的表达,抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等恶性进程。6.回复实验证明hsa＿circ＿0006354/hsa-miR-647/RUNX2轴参与调控骨肉瘤细胞的增殖与侵袭CCK-8与transewll实验结果表明:（1）过表达RUNX2可部分抵消hsa＿circ＿0006354敲低和过表达hsa-miR-647对骨肉瘤细胞增殖与侵袭的抑制作用（P＜0.001,P＜0.01）;（2）hsa-miR-647 inhibitor可部分抵消敲低hsa＿circ＿0006354导致的骨肉瘤细胞增殖和侵袭能力的降低（P＜0.001,P＜0.01）。结果表明hsa＿circ＿0006354/hsa-miR-647/RUNX2轴参与调控骨肉瘤细胞的增殖和侵袭。结论1.hsa＿circ＿0006354在骨肉瘤中具有促癌因子的作用,hsa-miR-647可抑制骨肉瘤细胞的癌性表型发展。2.hsa＿circ＿0006354靶向hsa-miR-647、RUNX2是hsa-miR-647的直接靶基因,沉默hsa＿circ＿0006354和上调hsa-miR-647均可降低MG63与U2OS中RUNX2的表达,细胞的增殖、迁移与侵袭能力均被抑制;下调hsa＿circ＿0006354后MG63的成瘤能力降低。