血吸虫病是由血吸虫感染引起的一种危害严重的人畜共患寄生虫病。据WHO的最新报道，人体血吸虫病流行于亚州、非洲及拉丁美洲的74个国家和地区，估计有7亿人口受到血吸虫病的威胁，约2.07亿人口被感染，其中85％的感染者存在于亚洲，每年全球约有百万人死于此病。我国是日本血吸虫病流行区，尚有454个疫区县(市、区)，约6千万人受到血吸虫病威胁，感染人数近41万。经过半个世纪的努力，至今仍未有一种安全有效的疫苗能成功应用于血吸虫病的预防。目前治疗与控制血吸虫病主要依赖于化学药物-吡喹酮，然而由于反复用药引起耐药性的机会将可能增加。因此，开发新的防治策略对血吸虫病的长期控制具有重要意义。血吸虫在其流行传播过程中，需要经历复杂的生命周期。若以干扰血吸虫的生命周期为靶点，通过对调控生长发育关键基因的寻找及其功能的研究可能达到阻断血吸虫生长发育的目的，为血吸虫病的预防提供新思路。　　 调节血吸虫生长发育的分子机制十分复杂，目前研究主要集中在TGF-β(转化生长因子beta)及PTK(蛋白酪氨酸激酶)信号通路的研究。由于扁形蠕虫的稳定细胞系至今尚未建立，哺乳动物细胞系常被用来评价一些血吸虫信号通路蛋白的功能。作为多梳蛋白家族(Polycomb group)成员之一，bmi1(B-cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site1，B细胞特异性小鼠白血病病毒整合位点1)基因已在模式生物及哺乳动物中显示具有调节生长发育、细胞增殖及维持干细胞自我更新的重要功能，然而对于日本血吸虫bmi1基因的功能所知甚少。本研究以BMI1的环指保守功能域序列对日本血吸虫的核酸序列数据库进行比对搜索，最终找到日本血吸虫的bmi1基因序列，命名为Sjbmi1。通过分子克隆表达技术获得纯化的SjBMI1蛋白及抗血清，血清学实验显示重组SjBMI1(rSjBMI1)蛋白可以被日本血吸虫感染血清识别，而且Anti-rSjBMI1抗血清可以识别成虫及虫卵粗抗原中的对应蛋白条带；定量PCR(qPCR)及免疫印迹(western blot,WB)实验证实Sjbmi1基因高表达于双性感染的成虫及虫卵阶段，免疫荧光(immunofluorescence，IF)实验显示在双性感染的雄性成虫的睾丸及雌性成虫的卵巢高表达SjBMI1，而单性感染的雄虫睾丸及雌虫卵巢未显示SjBMI1的表达；Sjbmi1基因可以在人鼻咽癌细胞(CNE2)中进行异源性表达，并且MTT、细胞周期检测、损伤修复实验及细胞核Hoechst染色实验显示Sj bmi1的表达会抑制CNE2细胞增殖活性及迁移能力，并促进细胞凋亡；WB及逆转录PCR实验显示SjBMI1可抑制内源性人BMI1(hBMI1)蛋白表达，但对hBMI1 mRNA的表达没有影响，揭示其抑制作用主要在转录后的蛋白表达阶段。　　 本论文对SjBMI1基因的结构特征、表达模式及功能研究进行了较为系统的阐述，对深入理解日本血吸虫的生长发育、生命周期转换及生殖器官成熟机制具有重要意义，并从干预血吸虫的生长发育角度为血吸虫病的防治提供了重要线索。　　 1、研究目的：　　 基于哺乳动物及模式生物研究中bmi1基因在生长发育、细胞增殖及干细胞自我更新方面的重要功能，寻找与认识日本血吸虫bmi1同源基因将对血吸虫防治工作及深入理解日本血吸虫的生长发育机制具有重要意义，本研究目的包括：　　 (1)寻找识别、克隆表达及鉴定Sjbmi1基因；(2)研究SjBMI1在不同发育阶段的表达模式及其组织学定位，探讨其在日本血吸虫生长发育及生殖器官形成中的作用；(3)异源性表达Sjbmi1基因，在细胞水平探讨其调控细胞增殖的可能机制。　　 2、研究方法：　　 2.1日本血吸虫bmi1(Sjbmi1)的基因识别及基因结构　　 从公共数据库下载人、大鼠、小鼠、果蝇的bmi1基因序列，进行序列比对，找出环指保守功能域，以此序列在日本血吸虫核酸序列库中进行tblastn比对，找到一条与hBMI1相似度最高的EST序列(GenBank Accession NO.AY815872.1)，进一步分析其ORF序列，发现在第93位可能存在点缺失，最终通过测序证实在此位点缺失一个T碱基(完整序列：gb/Eu912526.1)。将Sjbmi1全长序列与日本血吸虫DNA数据库进行对比，找出包含此基因的contigs，从而分析Sjbmi1基因的外显子与内含子分布。　　 2.2Sjbmi1的生物信息学分析　　 利用ExPASY的生物信息学工具进行SjBMI1理化特征的预测、结构域的分析、三维空间结构的构建及针对关键功能域进化树的绘制。　　 2.3Sjbmi1的基因扩增、克隆和重组蛋白的表达纯化　　 2.3.1Sjbmi1的基因扩增、克隆：根据目的基因的ORF和原核表达质粒pET-28a多克隆位点设计引物，利用聚合酶链反应(PCR)从日本血吸虫成虫cDNA中扩增出Sjbmi1的CDS。定向克隆该序列到质粒pET-28a中，对重组质粒进行PCR、双酶切和测序鉴定。　　 2.3.2 rSjBMI1蛋白的表达和纯化：将构建好的重组质粒pET28a-SjBMI1转化至大肠杆菌BL21(DE)，诱导表达后，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰电泳(SDS-PAGE)鉴定rSjBMI1蛋白的表达，亲和层析获得纯化的rSjBMI1蛋白。　　 2.4 rSjBMI1的免疫血清学鉴定　　 rSjBMI1免疫大鼠后获得抗血清。用WB法鉴定rSjBMI1，包括用rSjBMI1抗血清识别日本血吸虫虫卵与成虫的粗抗原、感染S.japonicum的兔血清识别rSjBMI1蛋白及抗HIS-tag单克隆抗体识别rSjBMI1蛋白。　　 2.5Sjbmi1在日本血吸虫不同发育阶段的表达　　 TRIzol法分别提取日本血吸虫虫卵、尾蚴、双性感染的雄性成虫及雌性成虫的总RNA，逆转录后获得cDNA，采用设计的特异性引物，利用定量PCR(qPCR)对cDNA中的Sjbmi1基因进行扩增，了解不同阶段其mRNA表达水平。各取20μg不同阶段虫体粗抗原用于WB分析，了解不同阶段SjBMI1蛋白表达水平。　　 2.6 SjBMI1在日本血吸虫的组织定位　　 制备虫卵及成虫的组织切片，采用免疫荧光法，用抗rSjBMI1大鼠血清对虫卵、双性感染的雄性成虫、雌性成虫及单性感染的雄性成虫、雌性成虫中的SjBMI1进行免疫定位。　　 2.7Sjbmi1基因的表达对鼻咽癌细胞增殖能力的影响　　 构建pIRES2-EGFP-SjBMI1重组质粒，质脂体转染后在人鼻咽癌细胞(CNE2)中进行异源性表达。采用MTT及细胞周期法评价细胞增殖活性，细胞核染色法评价细胞凋亡水平，损伤修复试验评价细胞的迁移与增殖能力。　　 2.8Sjbmil基因对内源性hbmi1基因表达的影响　　 在人鼻咽癌细胞中进行Sjbmi1基因的瞬时表达后，提取mRNA并逆转录成cDNA，PCR法检测hbmi1基因的mRNA水平；提取总蛋白，WB法检测hBMI1基因的蛋白水平。　　 3、研究结论：　　 3.1生物信息学分析、测序及免疫血清学实验证实gb/EU912526.1序列为日本血吸虫SjBMI1的编码基因，其ORF编码354个氨基酸，具有环指保守功能域，在物种进化过程具有保守性　　 3.2构建了重组原核表达质粒pET28a-SjBMI1，并成功表达分子量约为43.5kD的重组蛋白rSjBMI1　　 3.3Sjbmi1基因表达于日本血吸虫虫卵、双性感染的成虫阶段，且分布在成虫睾丸与卵巢，而单性感染的雌、雄成虫表达水平明显降低，揭示该基因可能与性发育成熟相关　　 3.4Sjbmi1可能在转录后水平抑制内源性hBMI1，并抑制CNE2细胞增殖与迁移能力