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目的:研究表明,HBV前S2具有PHSA受体,可介导HBV病毒颗粒吸附到肝细胞表面,在乙型肝炎入侵肝细胞中发挥重要作用,前S2蛋白上含有多个特异性T、B淋巴细胞结合位点,能引起中和抗体和保护性免疫的发生。因此,本研究首先拟构建含乙型肝炎病毒(HBV)PreS2基因的原核表达载体并在大肠杆菌中高效表达,获得纯化的PreS2融合蛋白,并对其性质进行鉴定。然后利用杂交瘤技术制备小鼠抗乙型肝炎病毒PreS2的单克隆抗体。作为进一步研究乙型肝炎病毒PreS2生物学功能以及PreS2在HBV感染中作用的工具。为预防和治疗乙型肝炎提供新的思路。方法:1.采用PCR法扩增含Bgl II与SalⅠ酶切位点的PreS2基因片段,原核表达载体pGST-MOLUC及PCR产物经双酶切后,用T4DNA连接酶将两者连接并转化到大肠杆菌JM109构建并筛选重组质粒。随后将重组质粒转入表达宿主菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达,对表达蛋白进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测。以谷胱甘肽-Sepharose 4B凝胶为填料进一步采用亲和层析纯化融合蛋白。2.用PreS2融合蛋白作为抗原免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术,制备抗PreS1的单克隆抗体,用ELISA方法来筛选能分泌抗PreS2单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞克隆,采用间接ELISA方法和Western-blot进行mAb特异性鉴定;同时采用间接ELISA方法鉴定mAb的Ig亚类,检测mAb的效价及相对亲和力,并进行mAb结合表位分析。并对其染色体进行分析。结果:1.用PCR方法扩增出与预期大小一致的目的基因片段。重组质粒经双酶切鉴定及测序分析证实重组质粒克隆成功,命名为pGST–PreS2。转化表达宿主菌后成功诱导出分子量为33kD的GST–PreS2融合蛋白,与预期分子量相符,诱导表达融合蛋白约占总菌蛋白的10%左右。Western-blot检测表明诱导表达的融合蛋白能与抗GST的单抗发生特异性结合。采用谷胱甘肽-Sepharose 4B凝胶纯化融合蛋白,纯化蛋白纯度约为90%左右。2.成功筛选出两株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞7A61和5E73,其抗体亚类为IgG1;将生长良好的杂交瘤细胞接种到预处理的Balb/c小鼠腹腔中制备腹水型PreS2的单克隆抗体,酶联免疫吸附试验(ELISA)证明腹水效价可达10-7; Western-blot结果鉴定提示该单克隆抗体可以特异的结合PreS2。ELISA相加实验结果显示2株mAb识别不同的抗原表位。结论:综上所述,我们运用重组DNA技术与原核表达方法获得了PreS2融合蛋白,并对其进行了纯化,制备了PreS2单克隆抗体。为我们进一步探讨乙型肝炎病毒PreS2的生物学功能及其在HBV感染中的作用奠定了坚实的基础。为预防和治疗乙型肝炎提供了新的思路。