桑白皮汤对LPS致急性肺损伤的药效物质基础及作用机制研究

来源 :长春中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lishuangjie2009
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目的:在中医药理论指导下,基于中药整体性的谱-效关联研究思路,对桑白皮汤(SBPD)治疗急性肺损伤引起炎症反应的药效作用及其药效物质基础进行研究,并探讨SBPD的作用机制,为其临床应用提供科学依据。方法:1.通过建立脂多糖(LPS)诱导小鼠急性肺损伤(ALI)模型和LPS诱导巨噬细胞RAW264.7炎症模型,从整体和离体两方面进行SBPD药效研究。整体实验采用LPS诱导小鼠ALI模型,进行了外周血血常规检测以及肺组织病理检测,离体实验采用LPS诱导巨噬细胞RAW264.7炎症模型,通过比较cck8法检测细胞增殖情况和Griess法检测细胞中NO的分泌,确定药效学指标。2.基于谱效关联技术对SBPD的药效物质基础进行研究。采用高效液相色谱(HPLC)法建立SBPD不同批次指纹图谱,确定色谱条件,构建SBPD不同极性部位指纹图谱;通过前期药效学指标筛选,以NO含量测定作为指标,采用灰色关联度法,对SBPD不同极性部位指纹图谱与不同极性部位NO抑制率进行谱效相关性分析,探寻SBPD的药效成分。3.在前期药效学与药效物质基础的实验研究基础上,对SBPD抗炎的作用机制进行探讨。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)法,免疫组化(IHC)法和蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测小鼠肺组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、Toll样受体2(TLR2)、髓样分化因子(My D88)、核转录因子-kappa B(NF-κB)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、白细胞介素1β(IL-1β)等蛋白表达情况,通过Western Blot法检测巨噬细胞RAW264.7中NF-κB、HMGB1、IL-1β等蛋白表达情况,从整体与离体两方面验证SBPD通过多种信号通路发挥抗炎作用和对肺损伤的保护作用。并对关联出的药效成分进行验证,通过复方与单体成分共同验证SBPD的抗炎作用。结果:1.药效学整体实验中,对小鼠外周血进行检测,LPS造模的小鼠外周血炎性细胞数量显著下降(P<0.01)。给药组外周血炎性细胞数量升高,且SBPD高剂量组显著升高(P<0.01)。通过观察HE染色结果,LPS模型组小鼠出现明显的炎症改变,表现为肺间质水肿、肺泡结构被破坏、炎性细胞浸润。给药组肺组织病理出现不同程度减轻,且SBPD高剂量组肺泡结构损伤较轻,炎性细胞浸润较少。离体实验中,筛选合适的药物浓度,确定LPS造模浓度为1μg/m L,通过比较cck8法检测细胞增殖情况和Griess法检测细胞中NO分泌,发现细胞中NO分泌更具代表性,确定SBPD抗炎的药效学指标为检测NO的分泌量。2.通过HPLC法确定色谱条件,建立SBPD不同极性部位指纹图谱,以水煎液为参照图谱,得到各部位指纹图谱,确定共有峰31个,Griess法检测SBPD不同极性部位细胞上清液中NO含量,通过灰色关联度软件将共有峰峰面积与NO抑制率进行关联,得到相应关联度,关联度大于0.7的色谱峰排序为20>12>13>9>11>2,选取抗炎活性关联度较大的20号峰和12号峰,作为后续实验研究对象。3.整体实验中,ELISA法检测小鼠肺组织中TNF-α含量发现,给药组与模型组比较,TNF-α明显降低(P<0.01);免疫组化结果显示,与模型组比较,给药组各蛋白表达明显降低;Western Blot结果显示,给药组各蛋白表达有所降低。离体实验中,SBPD给药组各蛋白表达降低,通过对单体成分进行验证,发现单体成分均可降低相关蛋白表达。结论:本研究对SBPD治疗呼吸道炎症的药效物质基础和作用机制进行了研究。首先从整体实验与离体实验两方面入手,证实了SBPD的抗炎的药效作用。其次,通过化学实验与药效实验,建立了SBPD不同极性部位指纹图谱,鉴别了SBPD的化学成分;同时对SBPD抗炎的功效进行评价,进而建立了SBPD抗炎作用谱效关系,初步筛选SBPD发挥抗炎作用的物质基础。最后,对SBPD抗炎的作用机制进行探讨,证明了SBPD可通过多成分、多通路协同发挥抗炎作用,为其中医临床应用提供了科学依据。
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