论文部分内容阅读
土壤微生物资源是土壤生态环境的重要基础资源,在植物病害生物防治中扮演着重要角色。放线菌属是土壤微生物重要类群之一,因其能产生诸多结构新颖、生物活性显著的代谢产物,成为宝贵的生物防治资源。本文从江西、福建、河北等地采集的26份土样中,分离到一株对植物病原真菌具有较强拮抗作用的放线菌AUH-1。在对其进行菌种鉴定,抗菌活性测定的基础上,重点对发酵培养基的优化、代谢调控分析、抗菌活性评价、抑菌机理及活性产物初步分离鉴定等进行了研究,以期为其生防应用提供理论指导和直接依据。1.从采集的26份土样中,以西瓜枯萎病菌为供试菌株,采用平板对峙培养法初筛得到15株具有拮抗作用的放线菌菌株。将15株放线菌进行发酵,其发酵液采用管碟法对细菌、真菌、植物病原菌等指示菌进行抑菌活性测定,进一步复筛得到一株对水稻纹枯病菌和西瓜枯萎病菌具有最佳抑制效果的拮抗放线菌AUH-1。利用多相分类鉴定的方法综合确定了该菌分类地位,属黄麻链霉菌(Streptomyces corchorusii),并命名为黄麻链霉菌AUH-1。2.对黄麻链霉菌AUH-1的发酵培养基配方及其所产代谢产物的抑菌活性、稳定性进行了初步研究。采用响应面优化实验设计确定了黄麻链霉菌优化培养基成分的质量浓度为蔗糖3.1%、玉米淀粉0.25%、玉米浆4.5%、硫酸铵0.375%;采用抑制菌丝生长速率法测定了黄麻链霉菌AUH-1的抑菌活性,结果表明黄麻链霉菌AUH-1对供试8种植物病原真菌(西瓜枯萎病菌、烟草黑胫病菌、水稻纹枯病菌、辣椒疫病菌、葡萄座腔病菌、棉花枯萎病菌、棉花黄萎病菌和黄瓜枯萎病菌)的抑制效率分别达到81.81%、78.99%、68.25%、67.23%、29.66%、28.25%、24.67%和37.05%,说明该菌具有广谱的植物病原真菌拮抗特性;稳定性试验结果表明,其所产抗真菌活性物质对酸碱敏感,但是具有良好的热稳定性和紫外稳定性,具备开发生物农药的良好应用前景。3.黄麻链霉菌AUH-1各发酵代谢特征曲线表明,其所产抗菌活性物质在菌浓达到一定阶段时才开始大量合成。进一步通过发酵动力学模型拟合研究,得到了有关菌体生长、产物形成和基质消耗等模型和参数,各模型拟合度R2分别达到96.329%、95.954%和96.227%,相对误差均(27)5%,拟合效果较好,为该菌发酵工艺的进一步优化提供了动力学理论参考。4.以水稻纹枯病菌和西瓜枯萎病菌为靶菌初步探究了黄麻链霉菌AUH-1的抑菌作用机理,结果发现:黄麻链霉菌AUH-1能够抑制病原菌菌核及孢子萌发,抑制菌丝生长,增大细胞膜通透性,加速菌丝内的原生质、K+、Na+外渗,细胞膜中麦角甾醇的合成受到显著抑制,细胞膜脂质过氧化程度加剧,破坏菌丝蛋白质的合成代谢系统,从而最终影响菌体的正常生长发育,达到抑菌作用效果。由此可见,黄麻链霉菌AUH-1所产活性物质主要通过作用于植物病原真菌细胞膜,干扰/破坏膜结构与功能达到抑菌效果。5.发酵上清液和菌体胞内活性物质的测定结果表明:黄麻链霉菌AUH-1的活性物质主要存在于胞内;溶媒萃取结果显示正丁醇的萃取效果最好,根据相似相溶原理初步确定其属于中等极性物质;捷克八溶剂层析结果表明AUH-1的层析谱型与大环内酯类抗生素最接近,但主要的抗菌活性组分是否具有大环内酯类抗生素的特性仍有待进一步研究;薄层色谱结果发现:5个组分在层析板上得到分离,其中组分5具有最高的抑菌活性,组分1和组分3也存在抑菌活性,其余组分都没有抑菌活性;紫外吸收光谱结果表明其存在三个最大吸收峰,分别为197 nm、202 nm和256 nm;液相色谱分析探得当甲醇浓度为60%等度洗脱时,样品活性物质成分最多为17种,最大出峰时间为10.798 min;红外光谱扫描结果表明其中存在O-H、-CH2、C=O、C=C、C-N、C-H和C-O等;扫描电镜观察发现其表面光滑,局部存在褶皱和突起,具有粘弹性和吸附性;液质联用分析结果推测其分子量大致为301和318,结合红外光谱和紫外吸收光谱测定结果,黄麻链霉菌AUH-1抗菌活性物质可能为环状多羟基羧酸类化合物,但其具体结构仍需做进一步的鉴定。