巯基（SH）化合物由于其独特的生物活性而广泛的应用于保健品、医疗行业,但是目前应用的SH化合物多为化学合成品,天然SH化合物由于其高安全性、低毒副作用等优势引起了越来越多的关注。本研究以大豆球蛋白为研究对象,首先对酶解过程中SH含量及巯基肽（TCPs）的分布进行了研究,然后采用高专一性、高通量的二硫苏糖醇（DTT）还原-共价色谱联用法来制备大豆球蛋白酶解物（SGHs）中的TCPs,最后研究了TCPs与重金属离子的相互作用。本研究为从食品蛋白质酶解物中制备新型功能性肽提供了理论依据。1、建立了单溴二胺-高效液相（m BBr-HPLC）检测TCPs的方法,并对其在大豆球蛋白酶物中的应用进行了进一步分析。以还原型谷胱甘肽（GSH）为标样,研究了反应条件（p H、温度、时间和m BBr用量）对m BBr标记SH的影响,确定了最佳m BBr标记条件如下:p H 7.5,温度25°C,反应时间90 min,m BBr添加量为SH含量的10倍。在此条件下,转化率接近100%,m BBr对SH的专一性高,不与肽段的其他侧链基团反应,并且大豆非巯基肽的存在不影响SH的标记。标记产物在4°C、避光条件下15天内荧光强度没有显著性变化。SH浓度在10-90μM范围内,荧光面积与SH浓度线性关系良好,精密度和准确度较高,加标回收率在可接受范围内;不同侧链结构大豆TCPs标记后的荧光系数没有显著性差异。m BBr标记对TCPs色谱保留行为影响显著,对于RP-HPLC,标记后保留时间（t）与标记前保留时间（t₀）的关系为t=t₀+45.814×t₀^-0.863;对于SEC-HPLC,两者保留时间的关系为t=0.7987×t₀+3.4713。2、采用三种常用的商业蛋白酶:Alcalase、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶对二硫键还原后的11S球蛋白进行水解后,采用p H-Stat法对水解度（DH）变化进行监控。结果表明:还原11S酶解过程中,Alcalase酶解到120 min时DH已经达到最大值,木瓜蛋白酶120min之后酶解速率已经变的非常缓慢,胃蛋白酶120 min时酶解速率也逐渐放缓。还原之后11S的酶解速率明显增加。酶解过程中SH含量采用m BBr-HPLC进行测定,在充氮并加入乙二胺四乙酸二钠（EDTA）情况下,三种酶在前30 min酶解物中SH含量保持不变,但是随后SH含量不同程度降低。对于Alcalase,酶解2 h后SH的保留率为75.2%,木瓜蛋白酶的SH保留率为83.2%,胃蛋白酶酶酶解过程中SH含量基本不变。将m BBr标记水解产物的荧光色谱图与未标记水解产物的紫外色谱图进行对比分析,进一步考察了不同疏水性区段和不同分子量区段中单位质量肽中的SH含量。对于Alcalase和木瓜蛋白酶来说,随着酶解的进行,TCPs在不同结构的酶解物中分布的差异越来越小,趋于均匀地分布在酶解物中。胃蛋白酶酶解物中TCPs在高分子量肽段中含量很低,在低分子量肽段中含量较高,这种分布随着酶解的进行变化不大。3、建立了一种从复杂的SGHs中提取TCPs的高选择性的方法。首先,将SGHs中的二硫键用DTT还原为SH,对DTT的用量进行了优化和考察,提高了酶解物中TCPs的含量。然后,用Thiopropyl-Sephrose 6B共价色谱制备还原酶解物中的TCPs,对共价色谱的吸附、解吸条件进行了优化和考察。研究表明:二硫键还原时DTT最佳用量为20 m M,还原之后酶解物中的SH含量从1.8μmol/g提高到了113.8μmol/g。共价色谱的最佳条件为:酶解物的上样量为酶解物中SH含量为凝胶活性位点的80%,键合时间为30 min;解吸时DTT浓度为20 m M,解吸时间为20 min。此外,C18柱可以有效得将TCPs中的DTT和2-TP去除。MALDI-TOF-MS表明制备的TCPs中可检测到45个肽段,其中36个肽段中含有SH,说明Thiolpropyl-Sepharose 6B共价色谱对TCPs有很高的选择性。4、制备了不同SH含量和分子量的TCPs,以TCPs-金属离子复合物的稳定常数为指标,用p H电位法研究了SH含量和分子量分布对TCPs结合Pb²⁺、Cd²⁺、Hg²⁺的能力的影响。研究表明:相同DH、不同酶种类的酶解物制备的TCPs有不同的SH含量和分子量分布。TCPs中可解离的质子数随着DH的增大逐渐减少。相对于TCPs,添加重金属离子的TCPs的滴定曲线在p H 8.0-8.5范围内向下发生了很大偏移说明SH在配合物形成过程中起了重要作用。在25°C、I=0.1 M KCl、p H 2¹2范围内,TCPs与Pb²⁺、Cd²⁺、Hg²⁺形成了ML和ML₂两种结合形式的配合物。相对于低水解度的TCPs,DH=25%TCPs与Pb²⁺、Cd²⁺和Hg²⁺的结合能力最强。通过相关性分析发现,SH含量与ML₂型结合物的稳定常数有很强的正相关性,分子量分布对TCPs结合Pb²⁺能力的影响要强于Cd²⁺、Hg²⁺。5、研究了不同带电性质的TCPs的制备及其与Hg²⁺的结合特性。TCPs采用DTT还原-共价色谱相结合的方法从大豆球蛋白Alcalase水解物中制备,用SP Sepharose C25分为带正、负电荷的两部分,并用氨基酸分析、凝胶色谱、反相色谱对其进行了表征。不同带电组分的TCPs与Hg²⁺的结合特性采用紫外-可见光（UV-Vis）光谱法、圆二色（CD）光谱法和凝胶色谱（SEC-HPLC）法来研究。研究表明,SP Sepharose C25成功将TCPs分为了带正（PCF）、负电荷（NCF）的两部分,NCFSH含量为831.03μmol/g,PCFSH含量为608.27μmol/g。UV-Vis光谱、CD光谱表明:随着汞离子浓度的增大,TCPs中的SH与汞离子先后形成了Hg²⁺:SH=1:2、1:1、2:1的配合物。SEC-HPLC结果表明配合物的结合形式分别为ML₂、M₂L₂、M₂L。带电性质对TCPs与Hg²⁺的结合形式没有影响,但会影响配合物的稳定常数。对于NCF,M₂L₂和M₂L的稳定常数分别为1.22×10¹⁷和1.82,对于PCF分为为4.44×10¹⁸和2.12。NCF与Hg²⁺的结合能力大于PCF。