论文部分内容阅读
研究背景胃癌(Gastriccancer)是消化系统最常见的恶性肿瘤之一。近些年来,虽然胃癌的发病率有所下降但其死亡率一直居高不下,成为困扰人类健康的重大难题。从全世界范围来看,胃癌在亚洲地区的发病率最高,在中国位居癌症发病率的第二位。由于现有的胃癌诊断标志物缺乏灵敏性和可靠性以及胃癌早期临床指征不明显,大多数胃癌患者一旦确诊已是晚期,胃癌患者的五年生存率较低。因而,寻找新的诊断和治疗胃癌的灵敏性和特异性高的的靶点成为当务之急。本课题组之前研究发现JMJD2B(KDM4B),即组蛋白去甲基化酶在胃癌组织中高表达,具有促进胃癌细胞增殖、侵袭和迁移的能力。然而,在胃癌发生发展的过程中,JMJD2B的调控机制尚未完全阐明。研究表明,miRNAs是单链非编码的RNA分子,可以在转录后水平调节细胞的一系列生物学功能,包括调控细胞周期以及细胞增殖、分化、凋亡、代谢的进程等。因而miRNA的异常表达能够诱导肿瘤的发生和发展。鉴于此我们推测JMJD2B是否能受到miRNA的调控而参与胃癌的发生发展进程。我们通过生物信息学分析软件预测可以调控JMJD2B表达的miRNA分子,并通过一系列的细胞分子生物学实验验证了miR-491-5p可以调控JMJD2B的表达,参与胃癌的发生发展过程。此外,我们通过检测组织和血清中miR-491-5p的表达发现,miR-491-5p可能作为胃癌早期诊断的标志物。实验目的探讨在胃癌发生发展过程中miR-491-5p调控JMJD2B的分子机制,以及miR-491-5p作为胃癌诊断标志物的潜在价值。实验方法1、以JMJD2B为靶基因,通过四种生物信息学软件(miRDB、miRanda/microRNA.org、Microcosm Targets 和 DIANA-microTv3.0)预测能结合在JMJD2B 3’UTR端的潜在miRNA,综合分析后挑选出miR-491-5p作为研究分子。利用QRT-PCR检测不同的胃癌细胞系(BGC823、MGC803、SGC7901和HGC27)中miR-491-5p的表达水平差异。将化学合成的miR-491-5p mimics和miR-mimics control利用转染效率较高的脂质体Lipofectamine 2000,分别转染胃癌细胞系MGC803和SGC7901,用QRT-PCR检测miRNA的转染效率。在胃癌细胞系中转染miR-491-5p模拟物后使用Western blot方法,检测miRNA靶向的JMJD2B在蛋白水平的变化。2、利用双荧光素酶报告基因实验将JMJD2B 3’ UTR野生型载体pmiR-RB-REPORT_h-KDM4B WT 或 JMJD2B 3’UTR 突变型载体pmiR-RB-REPORT_h-KDM4B MUT 与 miR-491-5p mimics 或 miR-negative control mimics共同转染至胃癌细胞系MGC803,检测双荧光素酶活性,以验证miR-491-5p 能否结合在 JMJD2B 3’ UTR 端。3、将 miR-491-5p mimics 和 miR-negative control mimics 分别转染胃癌细胞系MGC803和SGC7901,利用克隆形成实验检测转染miR-491-5pmimics后对胃癌细胞系克隆形成能力的影响;利用Transwell基质胶实验检测转染miR-491-5p mimics后对胃癌细胞系侵袭能力的影响;利用划痕实验检测转染miR-491-5p mimics后对胃癌细胞系迁移能力的影响。4、利用QRT-PCR检测miR-491-5p在胃癌组织以及胃癌患者血清标本中的表达,评估其是否能作为胃癌的潜在诊断标志物。5、利用QRT-PCR检测幽门螺杆菌菌株感染胃癌细胞系后miR-491-5p表达水平变化。实验结果1、四种生物信息学分析软件(miRDB、miRanda/microRNA.org、Microcosm Targets 和 DIANA-microTv3.0)预测结果显示,miR-491-5p 可以结合在 JMJD2B 3’UTR端。QRT-PCR检测结果显示,miR-491-5p在恶性程度比较高的胃癌细胞系BGC823、MGC803、SGC7901和HGC27中的表达水平相比在GES-1(永生化的胃上皮细胞系)中的表达明显下降,实验结果有统计学意义(P<0.001);将miR-491-5p mimics转染胃癌细胞系MGC803和SGC7901,与转染对照组相比,实验组中miR-491-5p表达量明显增高(P<0.001);将miR-491-5pmimics转染胃癌细胞系MGC803和SGC7901后,Western blot结果显示JMJD2B的蛋白水平表达降低,检测结果有统计学意义(P<0.01)。2、通过生物信息学分析软件TargetScan预测结果显示miR-491-5p在JMJD2B3’ UTR端有三个结合位点,因此我们构建了包含JMJD2B3’ UTR的如下载体:JMJD2B 3’ UTR的野生型载体,三个位点的总突变载体以及三个位点的单突变载体。使用双荧光素酶报告基因检测系统,与对照组检测相比,pmiR-RB-REPORT_h-KDM4B WT 与 miR-491-5p mimics 共同转染胃癌细胞系后,胃癌细胞系的荧光素酶活性明显下降(P<0.05);而当miR-491-5pmimics与三个位点的总突变载体共转染后,荧光素酶活性未出现明显下降;同时,三个单突变载体分别与miR-491-5p mimics共同转染胃癌细胞系后,荧光素酶活性未出现明显变化,以上结果表明miR-491-5p能够直接结合于JMJD2B 3’ UTR端,同时三个结合位点在miR-491-5p对JMJD2B的调控中都发挥作用。3、检验胃癌细胞系的克隆形成实验结果显示,当转染miR-491-5p mimics后胃癌细胞系的克隆形成能力显著受到抑制(P<0.05);Transwell基质胶实验结果表明转染miR-491-5pmimics能够降低胃癌细胞系的侵袭能力(P<0.05);细胞划痕实验结果显示转染miR-491-5p mimics后能抑制胃癌细胞系的迁移能力(P<0.05)。4、QRT-PCR检测结果显示JMJD2B在胃癌组织中的表达比癌旁正常组织的表达量升高,而miR-491-5p在胃癌组织中相比正常组织表达量下降;miR-491-5p在胃癌患者血清中表达相比正常人群明显降低,用ROC曲线评估miR-491-5p诊断胃癌的价值,AUC为0.919,95%CI为0.874-0.963,敏感度为94.2%,特异性为76.2%。实验结论1、MiR-491-5p通过靶向结合JMJD2B 3’ UTR端的三个位点而抑制JMJD2B的表达以及抑制胃癌细胞系的克隆形成能力、侵袭和迁移能力。2、MiR-491-5p在胃癌组织以及胃癌患者血清中均表达明显降低,提示miR-491-5p可能作为一种新的胃癌诊断标志物。