【摘 要】
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目的:乳腺癌(Breast cancer,BC)是女性常见的恶性肿瘤,其发病率位居世界首位,死亡率位居第二,严重影响着女性健康。血清和糖皮质激素诱导激酶3(Serum-and glucocorticoid-inducible kinase 3,SGK3)属于AGC蛋白激酶的SGK家族蛋白分子之一,在多种癌症的发生发展进程中有着不可忽视的作用。然而,SGK3对BC的生存及进展作用尚未完全阐明。本研究
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目的:乳腺癌(Breast cancer,BC)是女性常见的恶性肿瘤,其发病率位居世界首位,死亡率位居第二,严重影响着女性健康。血清和糖皮质激素诱导激酶3(Serum-and glucocorticoid-inducible kinase 3,SGK3)属于AGC蛋白激酶的SGK家族蛋白分子之一,在多种癌症的发生发展进程中有着不可忽视的作用。然而,SGK3对BC的生存及进展作用尚未完全阐明。本研究拟查明SGK3在BC中的表达以及对BC患者生存时间的相关性,探索SGK3对BC细胞(MCF-7和T47D)的增殖、凋亡以及自噬的影响及主要分子机制,为临床BC的治疗提供潜在的分子靶标。方法:1.利用GEPIA、TCGA、Oncomine数据库初步探讨SGK3在乳腺癌以及其它常见癌症中的表达水平;使用TCGA、ULCAN、KaplanMeier数据库分析SGK3对乳腺癌患者生存时间以及生存率的影响。2.采用MTT实验,平板克隆实验表征经过表达及敲低SGK3水平后对ER+BC细胞增殖的影响。3.运用流式细胞术探究过表达及敲低SGK3对ER+BC细胞凋亡的影响;免疫印迹(Western blot,WB)实验检测过表达SGK3对凋亡调控蛋白Bax、Bcl-2、PARP、Cleaved-PARP等的影响。4.通过免疫荧光检测SGK3水平影响ER+BC细胞中自噬流的程度;电子投射显微镜检测过表达以及敲低SGK3后细胞自噬小体的形态和数量变化;WB检测细胞过表达以及敲低SGK3后对自噬相关分子LC3A/B-Ⅱ/Ⅰ和Beclin1的蛋白表达以及其他自噬相关蛋白的变化。5.通过WB检测不同SGK3水平对P38 MAPK-m TOR-ULK1信号通路的影响作用,重点检测P38 MAPK、P-P38 MAPK、m TOR、Pm TOR、ULK1、P-ULK1水平。6.采用P38 MAPK抑制剂SB203580处理细胞后对自噬相关分子LC3以及P38 MAPK、P-P38 MAPK、m TOR、P-m TOR、ULK1、PULK1的影响,IF检测自噬流的变化。研究结果:1.数据库TCGA结果表明,与正常组织相比,SGK3在结肠癌、弥漫性大B细胞淋巴癌、食管癌、头颈部肿瘤、头颈鳞状细胞癌高表达;对比分析TCGA数据库中1084例乳腺癌患者和492例正常乳腺增生患者的基因证实,SGK3在乳腺癌患者显著高表达;数据库Oncomine印证了SGK3在包含浸润性导管乳腺癌、浸润性小叶乳腺癌、男性乳腺癌及混合型乳腺癌中均呈明显地高表达;数据库Kaplan-Meier Plotter显示SGK3高表达BC患者的总生存时间(Overall Survival,OS)及无病生存时间(Disease Free Survival,DFS)比低表达患者更短。2.MTT实验、平板克隆实验表明高表达SGK3能够显著促进BC细胞活力和增殖,而敲低SGK3能够抑制细胞活力及增殖。3.过表达SGK3能够显著下调促凋亡蛋白Bax和Cleaved-PARP表达,上调抑凋亡蛋白Bcl-2表达,降低了BC细胞的凋亡比率;敲低SGK3后能够明显增加细胞的凋亡水平,上调了Bax和CleavedPARP表达,并下调Bcl-2水平。4.过表达SGK3能够引起BC细胞内自噬小体数量的减少和LC3B荧光斑点的减弱,促进LC3脂化水平和Beclin1表达降低;低表达SGK3能够显著增加BC细胞胞内自噬小体的数量,促进LC3B脂化水平和Beclin1表达,显著提高了BC细胞的自噬水平。5.BC细胞内高表达的SGK3能显著促进P38 MAPK、m TOR,ULK1表达,P-P38 MAPK、P-m TOR、P-ULK1水平;相反,低水平的SGK3能降低这些蛋白的表达;SB203580能显著抑制BC细胞内m TOR和ULK1表达水平,增加LC3脂化水平和自噬小体标志物荧光斑点数量,显著改变了SGK3影响P38 MAPK信号通路对自噬的调节。研究结论:1.SGK3在多种类型的BC中均显著高表达,其表达BC患者的生存时间呈显著负相关。2.高表达的SGK3能显著降低Bax,Cleaved-PARP蛋白水平,增加Bcl-2表达水平来减少BC细胞凋亡并促进细胞增殖,实现对细胞的保护作用。3.高表达SGK3能显著降低BC细胞中LC3B和Beclin1表达并影响P38 MAPK-m TOR-ULK1信号来降低细胞自噬防止过度自噬造成的细胞伤害。
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