植物激素在植物生长发育以及应答生物或者非生物胁迫的过程中发挥至关重要的作用。独脚金内酯(Strigolactones,SLs)是一类新确定的植物激素,能够促进寄生植物种子的萌发和丛枝菌根真菌与宿主建立共生关系,在茎部能抑制植物侧芽生长发育从而减少植物的分枝数目,在根部能抑制侧根的形成、促进初生根的伸长。在独脚金内酯信号途径中,当独脚金内酯缺乏时,D53蛋白与TPL/TPR蛋白通过互作共同抑制下游基因的表达;当独脚金内酯被其受体蛋白D14识别后,D14发生构象变化并与SCFD3复合体以及D53互作,D53蛋白发生泛素化修饰并通过26S蛋白酶体降解,从而解除对其下游基因表达的抑制。因此,泛素-蛋白酶体降解途径在独脚金内酯的信号转导中起着非常重要的作用。　　尽管遗传学实验表明水稻中D53蛋白在体内的泛素化修饰和降解依赖于D3蛋白的活性,但是SCFD3复合体对D53蛋白进行泛素化修饰的机制仍不清楚。为了研究SCFD3复合体能否直接对D53蛋白进行泛素化修饰,以及鉴定调控该修饰过程的生化机制,有必要在体外重组SCFD3E3连接酶的活性。SCF E3复合体是一类多亚基的E3连接酶,目前在植物中还没有关于体外重组多亚基E3连接酶活性体系的报道。体外重组SCFD3E3连接酶活性所面临的最大困难是获得有活性的复合体亚基。我们通过IP-LC-MS/MS质谱分析鉴定到组成SCFD3复合体的有效成分,包括SKP1、Cullin1和RBX1,然后通过His pull down的实验方法验证了所有组分之间的相互作用;筛选获得了能与水稻SCFD3E3连接酶协同工作的E2;通过昆虫杆状病毒表达体系表达并纯化了所有SCFD3复合体的成分,并将所有成分在体外进行重新组合,首次获得了真核系统表达的、有活性的SCFD3E3连接酶。d53蛋白在812位发生了R→T氨基酸替换,在813-817位(G-K-T-G-I)发生了氨基酸缺失。我们分别分析了SCFD3E3连接酶对D53蛋白和d53蛋白泛素化修饰的活性。实验结果显示体外重组的SCFD3E3连接酶能将D53蛋白进行泛素化修饰,而对d53蛋白的泛素化修饰相对较弱,这与我们之前的遗传学研究结果相吻合。　　由于酶与底物之间互作的瞬时性、数量庞大的细胞内泛素化修饰蛋白的干扰以及泛素化修饰蛋白的快速降解,使得筛选E3连接酶底物比较困难,尤其是多亚基的E3连接酶。我们目前所取得的体外重组SCFD3E3连接酶活性的进展,为进一步探索SCFE3连接酶的分子作用机制提供了重要基础。我们将利用类泛素化蛋白对SCFD3E3连接酶进行改造,实现筛选SCFD3E3连接酶底物的目标。　　D53家族蛋白是一类植物所特有的蛋白。解析D53蛋白的结构有助于更深入系统理解植物激素与植株形态建成之间的关系。鉴于D53蛋白在独脚金内酯信号途径中的关键作用,我们开展了D53蛋白结构生物学的研究,发现对D53及其互作蛋白进行体外表达和纯化,然后将各组分进行体外重组是解析D53蛋白结构较为有效的实验体系。