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研究背景及目的:心房颤动(简称房颤)是最常见的心律失常,其遗传因素在房颤发生发展过程中起重要作用。NUP155基因突变能够引起房颤,这是房颤的非离子通道遗传基础,为房颤发病机理提供了一种新的机制。NUP155基因编码一种核孔蛋白,其突变引起房颤的分子机制尚不清楚。有种假说认为NUP155蛋白是引发房颤的一个上游关键蛋白,可通过与其它蛋白质的相互作用,影响基因的表达而导致房颤。NUP155蛋白与其他蛋白相互作用功能的缺失,可能会改变mRNA和蛋白质的运输,进而影响下游基因的表达导致房颤的发生。为了验证这一假说,本研究将对NUP155蛋白的互作蛋白进行筛选,以阐明NUP155蛋白在房颤发生中的作用及地位。 方法:本研究构建了pET-28a-NUP155(1~10)表达载体和pET-28a-GST-TEV-NUP155(1~10)表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)Rosetta,诱导表达后,分别使用His亲和层析法和GST亲和层析法进行蛋白纯化,获得大量的重组蛋白,通过GSTpull-down法,筛选HeLa细胞中NUP155蛋白潜在的互作蛋白。SDS-PAGE分离pull-down复合蛋白,并通过MALDI-TOF质谱法鉴定pull-down互作蛋白。 结果:成功构建了20个表达载体,分别为pET-28a-NUP155(1~10)和pET-28a-GST-TEV-NUP155(1~10)。获得了2个高效表达融合蛋白的重组载体pET-28a-GST-TEV-NUP155(1,9)。GSTpull-down法,筛选得到了1个NUP155蛋白的互作蛋白BRE。 结论:GSTpull-down是一种高效的筛选互作蛋白的方法,本研究应用这种方法筛选到了1个NUP155蛋白的互作蛋白BRE,后续将通过GSTpull-down法或免疫共沉淀法鉴定NUP155与BRE间的相互作用,通过功能研究,揭示在心脏生理学及房颤发生中BRE能否影响NUP155的功能。