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目的:研制高危型人乳头瘤病毒16型免疫胶体金诊断试纸条,以用于宫颈癌的早期筛查。方法:利用基因克隆技术构建和表达HPV16E6基因,用镍柱亲和层析纯化HPV16E6蛋白;用HPV16E6蛋白免疫家兔,制备抗HPV16E6蛋白多克隆抗体;用HPV16E6蛋白免疫雌性Balb/C小鼠,用杂交瘤技术建立抗HPV16E6蛋白的单抗杂交瘤细胞株,用体外诱生法制备大量的单抗腹水;用鼠源单克隆抗体作为抗原免疫家兔制备高效价的兔抗鼠IgG即二抗;用获得的单克隆抗体、多克隆抗体和二抗建立了高危型人乳头瘤病毒HPV16型的胶体金免疫层析快速诊断方法。结果:利用基因克隆技术成功构建含HPV16E6基因原核表达质粒的工程菌pET-28a(+)-HPV16E6-BL21 Star- DE3 PlysS,DNA测序正确,Western Blotting鉴定诱导表达出的蛋白为HPV16E6蛋白;兔抗HPV16E6蛋白多抗的效价高达1:256000;细胞融合率达93.2%,筛选出阳性克隆11孔,两次有限稀释法克隆化培养,筛选出了6株能稳定分泌特异性抗HPV16E6蛋白单克抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1F9、2F10、3C5、3C6、4D4、5B10。免疫细胞化学检测时这些单抗仅与CaSki细胞(含HPV16型)发生特异性反应,而不与其Hela细胞(含HPV18型)发生反应,免疫组织化学检测时这些单抗只与宫颈癌鳞癌组织(含HPV16型)发生反应,而不与宫颈癌腺癌(含HPV18型)发生反应;间接ELISA方法检测兔抗鼠单抗IgG的多克隆抗体血清的效价高达1:256000;制备了30nm的胶体金颗粒,单克隆抗体(4D4株)的实际标记量为6ug/ml。将金标抗体固定于结合垫(玻璃纤维膜)上作为显色源,将兔抗HPV16E6蛋白多抗和兔抗鼠IgG的抗抗体喷画在硝酸纤维素膜上分别作为捕获线和质检线,通过正交试验确定三种抗体的最佳喷涂量后制成了HPV16型免疫胶体金诊断试纸条。结论:本研究成功地构建了含HPV16E6基因的原核表达质粒工程菌pET-28a(+)-HPV16E6-BL21 Star- DE3 PlysS,Western Blotting鉴定诱导表达的蛋白为HPV16E6蛋白,用镍柱亲和层析纯化了HPV16E6蛋白;制备了高效价的抗HPV16E6蛋白的多克隆抗体;获得6株能稳定分泌抗HPV16E6蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株;制备了高效价的兔抗鼠IgG抗抗体。将这三种抗体应用在HPV16的诊断上,研制完成高危型人乳头瘤病毒16型的免疫胶体金诊断试纸条。