杀虫剂啶虫脒的微生物代谢与降解研究

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本文采用微生物转化技术对新一代烟碱类杀虫剂啶虫脒(acetamiprid,AAP)进行代谢和降解研究。从自然界和菌种库中筛选到一株Stenotrophomonas maltophilia CGMCC 1.1788,采用静息细胞转化法,获得了一种AAP的N脱甲基化产物IM-2-1。杀虫活性测定结果表明IM-2-1和AAP的作用方式基本相同,具有内吸和触杀活性,其相对毒力下降至原药的10%。此外,还筛选到可转化AAP生成多种产物的真菌菌株Rhizopus sp.和Penicillium sp.X1,通过LC/MS分析,推测了这些产物的分子式,结合已报道的一些关于AAP动植物及土壤中的代谢途径,推测了AAP在Rhizopus sp.中的代谢途径。另外,本研究还筛选到了一些对AAP有较强降解作用的菌株,其中一株酵母菌株Rhodotorula mucilaginosaR1 20天降解率可达91.2%,对AAP残留物的处理有潜在的应用价值。以AAP为唯一氮源进行富集培养,从土壤和菌种库中筛选到8株可将AAP转化为一种极性更大的化合物的菌株。其中菌种库中的S.maltophilia CGMCC1.1788菌株具有较高的转化AAP的能力,转化样品经HPLC/MS分析,证明该极性更大的转化产物为AAP的脱甲基化衍生物。筛选到的其他几株菌通过16SrDNA结果分析表明,分别为微杆菌(Microbacterium),短小杆菌(Curtobacterium),苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)和梭状芽孢杆菌(Bacillus fusiformi)。选用S.maltophilia CGMCC 1.1788为进一步研究用菌种。采用5L发酵罐进行S.maltophilia CGMCC 1.1788的发酵和转化研究,实验结果表明,转化96h后,转化液中转化产物的含量可达到40mg/L转化液。采用乙酸乙酯进行萃取,虽然并不能将底物去除,但可有效地去除代谢峰对产物分离的干扰。萃取液经浓缩,有机相滤膜过滤后用TLC薄层分离产物,采用氯仿。甲醇展层剂系统(氯仿:甲醇=9:1),底物与产物的分离效果最好,洗脱浓缩,有机滤膜过滤,结晶后,可得到纯度为96%的产物晶体。晶体经质谱、核磁共振光谱分析,确认其结构为AAP的N脱甲基化的衍生物IM-2-1。S.maltophilia CGMCC 1.1788菌株在发酵培养菌体阶段,宜取对数生长期中期的细胞进行静息细胞转化,以得到较多的IM-2-1。S.maltophilia CGMCC 1.1788菌株转化0.5‰AAP生成IM-2-1的生长细胞和静息细胞转化动力学研究表明其对AAP还有一定的降解作用。在转化液中添加蔗糖可促进IM-2-1的生成,添加20%的蔗糖,转化7天IM-2-1的生成较对照组提高了10.7倍。底物AAP在浓度2g/L内对S.maltophilia CGMCC 1.1788脱甲基化酶的活性没有底物抑制作用,随着AAP浓度的增加,产物生成量也在不断增加。在静息细胞转化液中添加浓度为0.5和1mmol/L的PBO(细胞色素P450酶的抑制剂)时,脱甲基化活性分别被抑制55%和70%;在细胞培养过程中添加1‰(w/v)的细胞色素P450诱导剂MnCl2,甲苯,丙酮,乙醇和苯巴比妥可提高S.maltophilia CGMCC 1.1788脱甲基化酶的活力,说明S.maltophilia CGMCC 1.1788的脱甲基化酶可能是一种细胞色素P450酶。AAP及其转化物IM-2-1杀虫活性测定结果表明IM-2-1和AAP的作用方式基本相同,具有内吸和触杀活性。IM-2-1对蚕豆蚜有杀虫活性,以AAP的相对毒力为100计,转化物的触杀相对毒力仅为10.54,内吸相对毒力仅为13.13,触杀活性仅为内吸活性的15.87%。这表明在对蚜虫的防治中AAP的N脱甲基化是一个解毒的过程,因此S.maltophilia将AAP转化为IM-2-1降低了在土壤中利用AAP的活性。季氏毕赤酵母Pichia guilliermondii W1和粘质红酵母Rhodotorula mucilaginosa R1及青霉penicillium sp.X1在添加5%蔗糖的唯一碳源培养基中可降解AAP。培养20天后,R.mucilaginosa R1降解率可达91.2%,Penicillium sp. X1和P.guilliermondii W1分别为80.5%和40.8%。从本研究室保藏的菌种中筛选到一株根霉Rhizopus sp.菌株,通过HPLC分析发现其静息细胞转化可转化AAP为一系列极性更大的化合物,经LC/MS分析推测它们分别为IM-2-1,IM-1-3,IM-1-4,IM-2-3以及一种尚未报道过的(7-羟基化啶虫脒)。根据国内外关于AAP在动植物及土壤中代谢途径的有关报道,推测了AAP在Rhizopus sp.中可能的代谢途径。综上所述,本论文采用微生物转化法获得了N-脱甲基啶虫脒(IM-2-1),对蚜虫成虫生物活性较AAP低一个数量级,表明在对蚜虫的防治中AAP的N脱甲基化是一个解毒的过程。筛选到一些纯培养的真菌具有转化和降解AAP的能力,其中Rhodotorula mucilaginosa R1 20天降解率可达91.2%。推测了AAP在Rhizopus sp.中代谢的三条途径,并首次报道了转化为7-hydroxy AAP的途径。
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