当前,酶催化作为一项绿色可持续的催化技术,已被广泛研究并应用于药品、精细化学品及食品等制备领域。利用腈水合酶催化制备酰胺类工业产品,具有选择性高、条件温和、环境污染小等优势,更符合经济和绿色化学的发展方向。然而,游离的腈水合酶在应用过程中具有稳定性差、易失活、难以回收利用等诸多局限性。通过固定化的方式,制成固定化腈水合酶纳米生物催化剂,不仅能够解决以上问题,还能实现工业化的连续生产,具有较大的研究意义。此外,由于金属离子在腈水合酶活性中心的重要作用,所以加入特定的金属离子能够影响腈水合酶的活性,比如Fe2+和Co2+会显著提高腈水合酶的酶活。基于此,本论文从钴离子(Co2+)对钴型腈水合酶(Co-type NHase)活性的促进作用为出发点,致力于制备出含有钴离子的新型纳米载体,同时引入腈水合酶,制备腈水合酶纳米生物催化剂,来提高腈水合酶的活性和稳定性。该方面研究具有明显的创新性和重要的研究价值。本论文的研究工作有以下三个方面:(1)以钴盐和2-甲基咪唑为原料,制备分散均匀、大小均一的ZIF-67,并引入腈水合酶,制备腈水合酶纳米生物催化剂NHase@ZIF-67。经优化NHase@ZIF-67的制备条件,确定腈水合酶为3 mg/mL、固定化时间为12 h,此时酶活为180.17 U/g 固定化酶,相应蛋白负载量为167.58 mg/g 固定化酶,蛋白包埋率为95.12%。NHase@ZIF-67的最适温度为40℃,最适pH为7.0。同时,与游离酶相比,NHase@ZIF-67表现出了良好的热稳定性和pH稳定性,拓宽了腈水合酶的应用范围,同时提高了腈水合酶的机械稳定性和储藏稳定性。在重复利用7次后,NHase@ZIF-67仍能保持初始酶活的33.19%,可见其重复使用性良好。此外,将NHase@ZIF-67用于催化制备烟酰胺,在25℃下进行反应,当加入酶量为12.51 U,反应时间为7 h时,烟酰胺的产率达91.35%。(2)以钴盐和PBS缓冲液为原料,制备分散均匀、大小均一的Co3(P04)2纳米花,并引入腈水合酶,制备腈水合酶纳米生物催化剂NHase@Co3(PO4)2。Co3(PO4)2纳米花的平均孔径为5.88 nm,孔体积为0.0544 cm3/g;NHase@Co3(PO4)2的平均孔径为4.27 nm,孔体积为0.0356 cm3/g。经优化NHase@Co3(PO4)2的制备条件,确定固定化时间为48 h,此时酶活为238.47 U/g 固定化酶,相应蛋白负载量为214.60 mg/g 固定化酶,蛋白包埋率为96.11%。NHase@Co3(PO4)2的最适温度为40℃,最适pH为6.0。同时,与游离酶相比,NHase@Co3(PO4)2表现出了良好的热稳定性、pH稳定性及抗蛋白酶分解稳定性,拓宽了腈水合酶的应用范围;在重复利用7次后,NHase@Co3(P04)2仍能保持初始酶活的58.92%,可见其重复使用性良好。此外,将NHase@Co3(P04)2用于催化制备烟酰胺,在25℃下进行反应,当加入酶量14.65 U,反应时间为7 h时,烟酰胺产率达90.96%。(3)以钴盐和胱氨酸为原料,制备粒径分散均匀的BioMOF纳米粒子,即Co-Cys纳米花,并引入腈水合酶,制备腈水合酶纳米生物催化剂NHase@Co-Cys。经优化NHase@Co-Cys的制备条件,确定腈水合酶为3 mg/mL、固定化时间为3h,此时酶活为139.04 U/g 固定化酶,相应蛋白负载量为95.85 mg/g 固定化酶,蛋白包埋率为92.71%。NHase@Co-Cys的最适温度为40℃,最适pH为6.0。同时,与游离酶相比,NHase@Co-Cys表现出了良好的热稳定性、pH稳定性、机械稳定性等,对蛋白酶的分解也具有较好的耐受性,拓宽了腈水合酶的应用范围;在重复利用7次后,NHase@Co-Cys仍能保持初始酶活的62.48%,可见其重复使用性良好。此外,将NHase@Co-Cys用于催化制备烟酰胺,在25℃下进行反应,当加入酶量12.76 U,反应时间为7 h时,烟酰胺产率达86.36%。