目的:糖尿病是由于机体胰岛素分泌不足或胰岛素功能缺陷而导致的以慢性高血糖为临床特征的全身代谢性疾病,其发病率呈逐年增长趋势。随着糖尿病病程的发展,长期的高血糖状态会严重影响机体的各个器官结构和功能,从而出现糖尿病并发症,如糖尿病眼底病变、糖尿病肾病、糖尿病心血管疾病、糖尿病足溃疡等。骨骼肌是体内胰岛素发挥降糖作用的主要靶器官之一,对体内血糖稳定的维持发挥着重要的作用。但是当机体出现胰岛素抵抗时,会明显减少机体骨骼肌对葡萄糖的摄取和利用。糖尿病产生的高血糖和低胰岛素状态会直接影响骨骼肌及其周围神经的新陈代谢,会导致骨骼肌的损伤和萎缩,进而会导致骨骼肌的减少和力量的下降,进一步影响糖尿病患者的运动机能。所以针对改善糖尿病患者胰岛素的敏感性,改善骨骼肌对葡萄糖的摄取和利用,从而减少骨骼肌的损伤和萎缩的研究至关重要。胰岛素(Insulin)作为体内重要的降低血糖的激素,其在机体内主要是通过胰岛素信号通路发挥重要的降糖作用。胰岛素信号通路是由多种酶参与的级联酶促放大反应通路,该信号通路可以调控机体葡萄糖的吸收和代谢以及糖原的合成。胰岛素受体(ISR)的磷酸化,蛋白激酶(AKT)的磷酸化,磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的活化是胰岛素信号通路的重要组成部分。ISR中的酪氨酸被胰岛素受体磷酸化后,ISR由此被激活,进而与PI3K的调节亚基p85结合,PI3K被活化后将信号逐级向下传递。PI3K激活磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)生成磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3),生成的第二信使PIP3与信号通路下游的磷脂酰肌醇依赖性激酶(PDK1)和AKT结合,从而激活PDK1和AKT。此外,AKT也可以被活化的PDK1激活。蛋白激酶Cζ(PKCζ)也处于PDK1的下游通路中,可以被活化的PDK1激活。磷酸化的AKT和PKCζ均可以激活胰岛素受体信号通路最终的效应分子葡萄糖转运体4(GLUT4),促进GLUT4向细胞膜的转位,进而促进机体细胞对葡萄糖的吸收和利用。胰岛素受体信号通路PI3K/PDK1/AKT/PKCζ激活后,可以促进骨骼肌GLUT4向细胞膜的转位,这在调控机体葡萄糖稳定中起着重要作用。糖原合成酶激酶-3(GSK-3)作为胰岛素受体信号通路中的一个重要调节因子,其活性被抑制后,可以严重影响胰岛素受体信号传导、葡萄糖代谢以及糖原合成。研究表明谷氨酰胺(Gln)有增加胰岛素敏感性,影响葡萄糖转运、糖原合成、脂质降解的潜在作用,而且其在临床上的使用的确有降低糖尿病患者血糖的功能。因此,本实验探索Gln作用于高糖培养的大鼠骨骼肌成肌细胞L6后,L6细胞葡萄糖摄取的改变以及对胰岛素敏感性的改变。本实验在细胞的基因和蛋白分子水平上,采用RT-PCR(polymerase chain reaction)法和Western Blotting法深入地探讨Gln对胰岛素受体信号通路PI3K/PDK1/AKT/PKCζ以及GLUT4表达和转位影响。并且采用免疫荧光的方法验证Gln增强L6细胞GLUT4表达和转位的作用。本研究也用不同浓度的谷氨酰胺干预高糖培养的L6细胞,检测L6细胞葡萄糖摄取改变,采用Western Blotting法检测不同浓度谷氨酰胺干预后,胰岛素受体信号通路中的PI3K、AKT和GLUT4蛋白表达的改变。方法:1、对L6细胞进行Gln和Insulin干预之前,将对数期的L6细胞进行饥饿处理(培养基无牛血清和Gln)12 h,对细胞进行分组高糖干预(高糖培养基葡萄糖浓度为33 mmol/L),细胞分成六组:无Gln无Insulin无L-谷氨酰基-4-硝基苯胺(GPNA)对照组(对照组);无Gln有Insulin无GPNA干预组(Insulin干预组);有Gln无Insulin无GPNA干预组(Gln干预组);有Gln无Insulin有GPNA干预组(Gln+GPNA干预组);有Gln有Insulin无GPNA干预组(Gln+Insulin干预组);有Gln有Insulin有GPNA干预组(Gln+Insulin+GPNA干预组),然后对各组细胞分别进行不同的药物干预24 h;2、提取L6细胞的培养上清液,使用葡萄糖氧化酶法,检测各组细胞进行药物干预后,L6细胞葡萄糖摄取率的改变,葡萄糖摄取率能反应Gln对葡萄糖吸收的影响;3、提取各组L6细胞的总RNA,采用RT-PCR方法检测各组细胞胰岛素受体信号通路中PI3K、AKT、PDK1、PKCζ和GLUT4各因子mRNA表达水平,在基因水平检测Gln和Insulin对L6细胞的影响;4、提取各组L6细胞的总蛋白,采用Western Blotting方法检测各组细胞胰岛素受体信号通路中PI3K、AKT、P-AKT、PDK1、PKCζ、PPKCζ、GLUT4、GSK和P-GSK各因子蛋白表达,从蛋白水平检测Gln和Insulin对L6细胞的影响;5、提取各组L6细胞的细胞膜蛋白,利用Western Blotting方法检测各组L6细胞药物干预后细胞膜GLUT4蛋白变化,从而检测GLUT4向细胞膜转位变化;6、采用免疫荧光的方法验证各组L6细胞受药物干预后总GLUT4蛋白表达和转位到细胞膜GLUT4蛋白改变。7、用不同浓度的Gln干预L6细胞24h后,采用葡萄糖氧化酶法检测L6细胞对葡萄糖吸收的改变,采用Western Blotting方法检测不同浓度Gln对PI3K/AKT/GLUT4胰岛素受体信号通路的影响。结果:与对照组相比,葡萄糖氧化酶法结果显示Insulin干预组和Gln干预组葡萄糖摄取率分别增加2.21倍和1.67倍,而且Gln+Insulin干预组葡萄糖的摄取率增加最为显著,增加4.81倍。RT-PCR和Western Blotting结果显示,Gln显著上调了高糖培养的L6细胞胰岛素受体信号通路中PI3K、PDK1、GLUT4各因子基因和蛋白表达,促进胰岛素受体信号通路中AKT、PKCζ、GSK各因子磷酸化,进而促进GLUT4向细胞膜转运,激活胰岛素受体信号通路,增加L6细胞对葡萄糖摄取和利用。L6细胞免疫荧光实验结果表明Gln和Insulin的干预,增加L6细胞绿色荧光亮度以及定位于L6细胞膜边缘绿色荧光亮度。免疫荧光实验结果与Western Blotting实验结果保持一致,共同表明Gln和Insulin显著增加GLUT4蛋白总表达,也促进GLUT4向细胞膜转位。实验结果也表明Gln可以增加L6细胞对胰岛素的敏感性,使L6细胞对葡萄糖吸收和利用显著增加,而GPNA抑制剂则下调胰岛素受体信号通路中各因子的表达,从而显著降低Gln的降糖作用。与低糖培养L6细胞相比,高糖刺激减少L6细胞葡萄糖摄取,下调PI3K和GLUT4表达,减少AKT磷酸化。但Gln高浓度干预可以改善L6细胞对葡萄糖的摄取,当Gln浓度增加5倍时,L6细胞对葡萄糖的摄取最大,对PI3K/AKT/GLUT4激活最明显;当Gln浓度增加10倍时,L6细胞对葡萄糖的吸收反而减弱,对PI3K/AKT/GLUT4激活作用反而降低。结论:研究结果表明Gln上调胰岛素受体信号通路PI3K和PDK1的基因和蛋白表达,促进AKT和PKCζ磷酸化而不是蛋白的表达,促进GLUT4从细胞质向细胞膜转运。葡萄糖摄取和GSK磷酸化的结果也证明Gln增加L6细胞对胰岛素的敏感性,发挥显著的降糖作用。GPNA是Gln抑制剂,抑制机体对Gln吸收,从而降低Gln的降糖作用。这些研究结果表明Gln增强胰岛素敏感性可能是通过激活PI3K/PDK1/AKT/PKCζ胰岛素受体信号通路和糖原合成信号通路而实现。Gln干预L6细胞的浓度在一定范围内升高,L6细胞对葡萄糖的吸收和利用也随之增加,超过一定的浓度范围,谷氨酰胺的作用反而会下降。