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论文将从两个部分进行介绍。第一部分为拟南芥EFR蛋白重组表达、纯化及品体生长,第二部分为黑腹果蝇SCOT蛋白重组表达、纯化、初步晶体学研究及酶活测定。病原微生物在与植物在长期自然环境下共同进化过程中逐渐演化出一些特有的先天免疫系统,这种先天免疫系统包含一系列比较复杂的识别机制,能够让植物体自身通过识别和感知外源病原分子来启动自身防卫反应抵御外来入侵分子。病原微生物与植物在自然界中长期共进化的结果,使植物发展出不同层次的免疫系统。利用病原体相关分子模式介导的免疫应答反应(PTI, Pattern-triggered immunity)及效应子参与的自身免疫应答反应(ETI, Effector-triggered immunity)抵御不同种类病原微生物的侵染。植物体利用体内受体激酶如EFR和FLS2,辨别外源细菌病原菌并启动植物先天免疫反应,然而这种自身免疫反应通常被细菌效应蛋白等蛋白质所抑制,使外源病原微生物能够在植物体内大量繁殖而导致各利,病变。植物体为了对抗外源病原微生物,在长期的自然进化过程中产生了抗病基因来识别细菌表面效应蛋白并重新产生相对的抗性。拟南芥通过一种富含亮氨酸重复序列的类受体蛋白激酶(LRR-RLK, Leucine-rich repeat receptor-like kinase) FLS2(Flagellin-sensing2)来识别鞭毛蛋白中的细胞表面模式识别受体PRR。LRR-RLK是植物体内细胞膜上主要由胞内丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶区域,跨膜区及LRR膜外功能区组成的一类单跨膜蛋白。拟南芥EFR蛋白是延伸因子Tu(EF-Tu)和细菌鞭毛蛋白的受体,植物体依赖受体激酶(EFR)来感应病原体入侵并启动免疫反应。EFR和FLS2蛋白是目前研究中拟南芥植物体内仅知的两个PRRs。在细菌中大量存在的延伸因子Tu (EF-Tu, Elongation factor Tu)蛋白能够被拟南芥和十字花科其他成员识别为PAMP的成分。EF-Tu氨基酸序列中含有一段极度保守的elfl8序列,该序列N端前面的18个氨基酸发生乙酰化。elfl8和全长EF-Tu序列所介导的免疫应答反应完全一致。拟南芥生物体中的类受体蛋白激酶EFR (EF-Tu receptor),它负责识别EF-Tu。它与FLS2同属于LRRXII亚家族。实验研究中发现efr突变体对根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和具有弱致病力的Pst DC3000感病性变强,所以证明类蛋白激酶EFR对抵抗外源细菌起到十分重要的作用。目前植物体内的NB-LRR蛋白识别外源病原微生物效应因子激活并下游免疫应答反应的途径仍然不清晰。因此我们分别依次构建了拟南芥EFR(675-1031)-His-TEV-pET28a/EFR(681-1019)-His-TEV-pET28a/EFR(695-1002)-His-TEV-pET28a重组表达质粒。试表达检测表明除了EFR(695-1002)-His-TEV-pET28a蛋白不表达,其它两个亚克隆都能表达蛋白。通过Ni-NTA亲和层析柱进行纯化,发现EFR(675-1031)-His-TEV-pET28a/EFR-(681-1019)-His-TEV-pET28a表达出的目的蛋白可溶。EFR(675-1031)-His-TEV-pET28a和EFR(681-1019)-His-TEV-pET28a表达出的目的蛋白经Ni-NTA亲和层析和superdex200凝胶过滤层析后,得到高纯度的稳定均一蛋白用于蛋白晶体生长。通过坐滴气象扩散法,采用Hampton Research Crystal Screen Ⅰ、Crystal Screen Ⅱ、Salt RxTM1、Salt RxTM2、PEG RxTM1、PEG RxTM2、Emerald Biosystems Wizard Ⅰ、Wizard Ⅱ、Index Ⅰ和IndexⅡ蛋白晶体生长试剂盒进行蛋白晶体筛选。琥珀酰辅酶A转移酶(SCOT)催化琥珀酰辅酶A和乙酰乙酸生成乙酰乙酰辅酶A和琥珀酸。乙酰乙酰辅酶A在线粒体中硫解酶的作用下产生成两分子乙酰辅酶A,乙酰辅酶A进入柠檬酸循环。琥珀酰-CoA转移酶(SCOT)催化琥珀酰上的-CoA基团转移到乙酰乙酸上。乙酰乙酸酯是酮体的化合物之一。酮体由肝脏产生的,并通过血流转运至肝外组织,如心脏和大脑,被用作为生物体新陈代谢的一种能量。在这些肝外组织的线粒体中,SCOT蛋白催化反应生成乙酰乙酰CoA,乙酰乙酰CoA经硫解酶转化生成乙酰辅酶A。然后乙酰辅酶A再进入三羧酸循环为生物体新陈代谢提供能源。生物体内SCOT蛋白缺失会引起酮酸中毒。SCOT蛋白结合CoA后形成一个中间过渡态产物来催化反应的进行。通过William Jencks对猪心脏SCOT蛋白的实验研究发现,琥珀酰辅酶A上的CoA基团与SCOT蛋白上305位点上的谷氨酸残基结合,形成一个酸酐的中间体。然而,目前对于黑腹果蝇中的CoA转移酶的相关研究很少。所以,我们构建了黑腹果蝇中的CoA转移酶原核表达质粒Scot-His-TEV-pET28a,重组质粒经EPTG诱导表达出目的蛋白,目的蛋白通过Ni-NTA亲和层析以及superdex200凝胶过滤层析等蛋白纯化方法获得了纯度超过95%且均一性较好的目的蛋白。通过坐滴气象扩散法,采用Hampton Research Crystal Screen Ⅰ、Crystal Screen Ⅱ、Salt RxTM1、Salt RxTM2、PEG RxTM1、PEG RxTM2、Emerald Biosystems Wizard Ⅰ、Wizard Ⅱ和Index Ⅰ、Index Ⅱ晶体生长试剂盒进行蛋白晶体筛选,已经获得蛋白晶体并解析出空间结构。通过分光光度法在310nm紫外下测得黑腹果蝇SCOT蛋白酶活。