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目的：了解纳米二氧化硅的皮肤毒性，评价纳米二氧化硅的生物安全性提供实验依据。为全面评价纳米材料的安全性提供依据，也为建立起更加快速、灵敏、高效的安全性评价方法提供新思路。
方法：⑴设置溶剂(Ctrl)对照组、微米SiO2对照组(剂量同nm-SiO2最高剂量组，micro-SiO2)、nm-SiO2低剂量组(15nm、30nm、100nm)、nm-SiO2中剂量组(15nm、30nm、100nm)和nm-SiO2高剂量组(15nm、30nm、100nm)11个剂量组。对micro-SiO2及不同粒径的nm-SiO2进行表征(粒径分布、纯度、zeta电位、透射电镜图)；细胞生物效应的观察指标包括细胞增殖、LDH的漏出率、DNA损伤(8-OHdG、γH2AX、Comet assay)、细胞凋亡、细胞周期、活性氧(ROS)的产生以及氧化应激、损伤修复等相关基因的表达，处理时间均为24h。⑵在亚硫酸氢盐修饰基因组DNA的基础上，以甲基化特异性PCR(MSP)检测P53，P16，OGG1、PARP-1、MYH、MTH1启动子区域的甲基化状况；同时对对照组细胞，10μg/mL nm-SiO2的暴露HaCaT、HaCaT-shPARP-1、HaCaT-PARP-1细胞组的PARP-1、MYH启动子区域的部分CpG岛进行亚硫酸氢盐克隆测序，全面观察其CpG岛甲基化修饰状况。⑶以染色质免疫沉淀结合定量PCR的方法检测DNMT1、PARP-1基因转录调控区域的核糖基化及甲基化修饰情况。
结果：
⑴用0-100μg/mL nm-SiO2处理HaCaT细胞24h后发现细胞的存活率呈剂量依赖性降低，且与粒径呈反比。用一般概率模型法计算15nm、30 nm及100 nm的nm-SiO2作用于HaCaT细胞24h的IC50分别为19.43±1.3μg/mL、27.67±1.44μg/mL和35.91±1.59μg/mL。说明处理24h后nm-SiO2对HaCaT细胞存在着损害效应。除细胞周期外，nm-SiO2所引起的效应均比micro-SiO2严重，说明SiO2粒径尺度的改变对其毒性有显著影响，可能与胞内活性氧的产生水平有关。Q-PCR和Westernblot结果都提示PARP-1在nm-SiO2致HaCaT细胞的损伤中有重要作用。
⑵在nm-SiO2致HaCaT细胞损伤的过程中，5-mC免疫荧光及荧光强度的流式检测结果都提示DNA的总体甲基化程度有随nm-SiO2浓度升高而降低的趋势。同剂量的纳米级对照组比溶剂对照组及微米级对照组相比具有更低的基因组DNA甲基化水平。而PARP-1缺陷组有比10μg/mL nm-SiO2处理组更高的甲基化水平，而PARP-1过表达HaCaT-PARP-1组的5-mC水平则较低。用HPCE电泳检测HaCaT细胞的总体甲基化水平，结果则显示nm-SiO2可引起HaCaT细胞甲基化程度降低，呈剂量依赖性关系；与正常细胞相比，micro-SiO2、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL分别降低37.8％、43.9％、54.9％、52.8％，差异具有统计学意义(p＜0.05)与甲基化免疫荧光结果相似。对照组5-aza-dC处理后使HaCaT细胞甲基化程度减少27.3％，而相同的剂量下HaCaT-shPARP-1组则比10μg/mL组升高260.4％，而HaCaT-PARP-1组与10μg/mL组没有明显差别。
⑶细胞免疫荧光结果及流式分析结果均显示在nm-SiO2致HaCaT细胞损伤的过程中，PAR的免疫荧光结果都提示总体核糖基化的程度有随nm-SiO2浓度升高而升高的趋势。与溶剂对照组细胞(Ctrl)相比，micro-SiO2组的荧光强度为19.11，nm-SiO2染毒组(2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL)细胞组的荧光强度为20.54、26.54、37.59，而HaCaT-shPARP-1和HaCaT-PARP-1组则为7.01和49.44；对于3μM甲基化酶抑制剂DAC组则为40.21。应用PARPs检测试剂盒，观察nm-SiO2致HaCaT细胞损伤的过程中PARPs活性的变化趋势，与溶剂对照组细胞(Ctrl)相比，nm-SiO2染毒组(2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL)细胞的活性分别升高为28％、37％、70％，HaCaT-PARP-1组则相比对照组升高574％；对于3μM甲基化酶抑制剂DAC组则与对照组变化不明显。HaCaT细胞暴露于不同剂量的SiO2中，PARP-1的mRNA相对表达水平均以溶剂对照组细胞的表达量为对照，设其为1，其余各组的表达水平与之相比较，nm-SiO2染毒组(2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL)PARP-1的表达水平分别为对照组的93.2％、57.6％、23.5％，而HaCaT-shPARP-1和HaCaT-PARP-1组则为对照组的11.2％和534％；对于3μM甲基化酶抑制剂DAC组与对照组变化则为21.5％，micro-SiO2则与对照组没有差别。
⑷甲基化特异性PCR(MSP)结果显示在HaCaT细胞暴露于nm-SiO2的过程中，各剂量组的P53均未出现甲基化片段的扩增，但非甲基化扩增水平有随剂量上升而下降的趋势，对于P16，不同剂量组的细胞均具有不同程度的甲基化水平的扩增，呈现随增剂量的增大有升高的趋势，而PARP-1过表达细胞组HaCaT-PARP-1的甲基化程度最高。随着nm-SiO2剂量的增大，OGG1启动子区的未甲基化程度不断的升高，PARP-1过表达细胞株HaCaT-shPARP-1的未甲基化水平最高。对于MTH1，不同剂量的细胞均具有不同程度的未甲基化水平的扩增，但随剂量的增大而变化的趋势不是很明显，但DAC组未甲基化程度明显增强与DNMT1缺陷细胞相似。而PARP-1缺陷细胞HaCaT-shPARP-1在MTH1启动子区的未甲化程度比PARP-1过表达细胞稍高，过表达细胞组HaCaT-PARP-1的甲基化程度最高。对于MYH，不同剂量的细胞组甲基化与未甲基化均有不同程度的扩增，但随着剂量的增加甲基化程度有不同程度的增高，而PARP-1缺陷细胞H-shPARP-1的启动子区的甲基化程度明显增加，而PARP-1过表达细胞组HaCaT-PARP-1和DNMT1缺陷细胞株HaCaT-shDNMT-1组只有甲基化程度的扩增而未见未甲基化片段的扩增。随着nm-SiO2剂量的增大，PARP-1启动子区的未甲基化程度不断的降低。亚硫酸氢盐测序结果显示PARP-1的启动子区的甲基化程度很低，但其变化主要发生在-229位的CG位点上，可能这一位点的甲基化程度与PARP-1的表达有关，MYH启动子区的甲基化程度都很高，可能此区的甲基化状态并不参与MYH基因表达的调控。
⑸定量染色质免疫沉淀(Q-CHIP)结果提示DNMT1和PARP-1的上游启动子区均有不同程度的核糖基和甲基化修饰，其可能参与DNMT1和PARP-1活性的调控，也可能具有表观遗传学调控作用。
结论：① nm-SiO2具有显著的HaCaT细胞毒性。除细胞周期外，nm-SiO2所引起的效应均比micro-SiO2严重，说明SiO2粒径尺度的改变对其毒性有显著影响。Nm-SiO2能造成显著的DNA损伤，且损伤效应可能与胞内产生的活性氧有关，PARP-1可能在nm-SiO2致HaCaT细胞的损伤中有着重要作用。②nm-SiO2处理HaCaT细胞24h后，可引起整体基因组DNA甲基化降低，总体核糖基化升高，表观遗传学相关酶的表达与活性改变参与其形成与维持。③在HaCaT细胞暴露于nm-SiO2的过程中，特异基因表达发生变化，其转录调控区域特定的DNA甲基化和核糖基化修饰参与基因的转录调控。④纳米材料可以引起表观遗传学效应指标的改变，提示在今后的环境中及医学领域内应用的纳米材料的安全性评价中可增加表观遗传学的效应指标。