研究背景骨骼肌是身体健康的关键,骨骼肌结构及机能完好对于机体发挥正常功能极为重要。临床上,骨骼肌损伤和多种急慢性病直接相关。基因支持着生命的基本构造和性能,演绎着生命的繁衍、细胞分裂和蛋白质合成等重要生理过程,是决定生命健康的内在因素。尽管针刺被广泛应用于骨骼肌损伤相关疾病的治疗,但针刺对骨骼肌损伤后基因表达的影响尚不清楚,亟需采用先进的研究方法进行挖掘。转录组测序(RNA Sequencing)是一种前沿的基因表达变化检测方法,可客观剖析特定干预(如针刺干预)下,研究对象差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)的变化,并可探索在干预过程中起重要作用的差异表达基因富集提示的生物学功能及信号通路。故通过转录组测序探究针刺治疗骨骼肌损伤疾病的作用机制,可为针刺治疗骨骼肌损伤相关疾病的临床推广提供坚实的实验依据。未折叠蛋白质反应(unfoldedproteinresponse,UPR)是当细胞内内质网中错误折叠或未折叠的蛋白质大量积累时,所激发的用于维持蛋白质正常折叠的主要机制。骨骼肌损伤后常会引起骨骼肌内质网应激,诱发UPR途径激活,且UPR的3条通路在受损骨骼肌再生修复中发挥重要作用。结合转录组测序结果,去分析探索针刺是否可以通过调节UPR相关通路来促进受损骨骼肌的修复,值得我们去研究。研究目的通过观察针刺对受损骨骼肌差异表达基因的影响,探索针刺治疗骨骼肌损伤的基因层面的作用机制,研究其差异表达基因所提示的UPR相关生物信号通路,揭示针刺治疗骨骼肌损伤的部分机制。研究方法(1)针刺“阿是穴”对腓肠肌损伤小鼠差异表达基因的影响。将108只C57BL/6J小鼠依据随机数字表法分为正常组、模型对照组、模型组、针刺组。模型组及针刺组小鼠采用双侧腓肠肌局部注射布比卡因的方法造模。针刺组于造模后24h进行针刺阿是穴干预,共干预1次。针刺干预结束后,采用HE染色观察各组小鼠不同时间点(48 h、72 h、7 d)腓肠肌形态学的变化,采用RNA-Sequencing技术检测各组小鼠腓肠肌基因表达情况。(2)针刺/电针“委中穴”对腰多裂肌损伤小鼠差异表达基因的影响。将72只C57BL/6J小鼠依据随机数字表法分为正常组、模型组、针刺组、电针组。模型组、针刺组及电针组小鼠采用双侧腰多裂肌局部注射布比卡因的方法造模。针刺组与电针组于造模后24 h开始针刺/电针干预,20 min/次/天,共干预3次。采用转棒试验测试各组小鼠的运动平衡能力,HE染色法观察各组小鼠腰多裂肌形态学的变化,并采用RNA-Sequencing技术检测各组小鼠腰多裂肌基因表达情况。(3)针刺对骨骼肌损伤小鼠UPR相关通路调节作用的研究。将42只C57BL/6J小鼠依据随机数字表法分为腓肠肌模型对照组、腓肠肌损伤模型组、针刺“阿是穴”组、腰多裂肌模型对照组、腰多裂肌损伤模型组、针刺“委中穴”组、电针“委中穴”组。2个模型对照组局部肌肉注射生理盐水,其余5组小鼠采用局部肌肉注射布比卡因的方法造模。针刺“阿是穴”组于造模后24 h进行针刺阿是穴干预,共干预1次;针刺“委中穴”组和电针“委中穴”组于造模后24 h开始行针刺/电针“委中穴”干预,20 min/次/天,共干预3次。全部干预结束后,采用Western blot及Real-time PCR检测各组小鼠UPR相关通路蛋白p-IRE1、IRE1、XBP1、ATF6、p-eIF2α、eIF2α、CHOP 及其对应 mRNA 的表达情况。研究结果(1)针刺“阿是穴”对腓肠肌损伤小鼠差异表达基因的影响HE染色结果显示,造模24h后,与正常组相比,模型组显示出严重的肌纤维肿胀和断裂。与模型组相比,针刺组在干预48h、72h和7d都显示出随时间变化的更好的再生效果,肌纤维肿胀减少,断裂的肌纤维减少,出现更多细胞核位于肌纤维中间的新生肌纤维。转录组学分析结果显示,与模型对照组相比,模型组上调的DEGs为987个,下调的DEGs为73个;与模型组相比,针刺组上调的DEGs为623个,下调的DEGs为65个。进一步分析显示,腓肠肌损伤后显著调节的基因主要参与的生物学功能及信号通路包括肌动蛋白细胞骨架、趋化因子信号通路;针刺“阿是穴”后显著调节的基因主要参与的生物学功能及信号通路包括细胞器内膜、生热作用及氧化磷酸化相关信号通路。(2)针刺/电针“委中穴”对腰多裂肌损伤小鼠差异表达基因的影响转棒试验结果显示,与正常组相比,腰多裂肌损伤后,模型组小鼠各时间点转棒成绩均略有下降,但差异均无统计学意义(P>0.05);与模型组相比,针刺/电针干预后,针刺组与电针组小鼠转棒成绩略有提高,但均无统计学差异(P>0.05)。HE染色结果显示,与正常组相比,小鼠腰多裂肌造模48 h后,模型组表现出严重的炎性细胞浸润和肌纤维断裂;与模型组相比,针刺/电针干预后,针刺组及电针组炎性浸润及断裂肌纤维明显减少。转录组学结果显示,与正常组相比,模型组上调的DEGs为2063个,下调的DEGs为1181个;与模型组相比,通过针刺或者电针干预后,针刺组上调的DEGs为80个,下调的DEGs为93个;电针组上调的DEGs为59个,下调的DEGs为126个。进一步分析发现腰多裂肌损伤导致上调的DEGs中,针刺“委中穴”逆转的DEGs为48个,电针“委中穴”逆转的DEGs为21个;损伤导致下调的DEGs中,针刺“委中穴”逆转的DEGs为23个,电针“委中穴”逆转的DEGs为7个。腰多裂肌损伤后诱发的DEGs主要参与的生物学功能及信号通路包括肌动蛋白细胞骨架、趋化因子信号通路等。而针刺“委中穴”后诱发的DEGs主要参与的生物学功能及信号通路包括包括先天免疫反应、趋化因子活性、趋化因子信号通路。电针“委中穴”后诱发的DEGs主要参与的生物学功能及信号通路包括NADH脱氢酶活性、生热作用、氧化磷酸化相关信号通路。(3)针刺对骨骼肌损伤小鼠UPR相关通路蛋白及基因的影响腓肠肌损伤模型小鼠Western blot及Real-time PCR结果显示:与腓肠肌模型对照组相比,腓肠肌损伤模型组p-IRE1/IRE1显著升高(P<0.01);与腓肠肌损伤模型组相比,针刺“阿是穴”组XBP1 mRNA及蛋白表达升高(P<0.05,P<0.05)。腰多裂肌损伤模型小鼠Western blot及Real-time PCR结果显示:与腰多裂肌模型对照组相比,腰多裂肌损伤模型组IRE1蛋白表达显著下降(P<0.01),p-eIF2α/eIF2α显著降低(P<0.01);与腰多裂肌损伤模型组相比,针刺“委中穴”组p-IRE1/IRE1显著升高(P<0.01),IRE1 mRNA 表达升高(P<0.05),ATF6 蛋白表达升高(P<0.05),CHOP mRNA及CHOP表达升高(P<0.05,P<0.05);与腰多裂肌损伤模型组相比,电针“委中穴”组p-IRE1/IRE1显著升高(P<0.01),IRE1 mRNA及XBP1 mRNA表达显著升高(P<0.01,P<0.01),ATF6 mRNA 及 ATF6 表达升高(P<0.01,P<0.05),p-eIF2α/eIF2α显著升高(P<0.01),eIF2αmRNA 表达升高(P<0.05),CHOP mRNA 及 CHOP 表达升高(P<0.05,P<0.01)。结论(1)骨骼肌注射布比卡因可引起炎症反应,诱导产生大量差异表达基因(DEGs)。GO/KEGG富集分析提示布比卡因肌肉注射可能通过影响肌动蛋白细胞骨架、趋化因子信号通路等诱导骨骼肌损伤。(2)针刺“阿是穴”可以进一步上调腓肠肌损伤诱导的DEGs的表达。GO/KEGG富集分析提示,针刺“阿是穴”可能通过调节细胞器内膜、生热作用和氧化磷酸化促进受损骨骼肌修复。(3)针刺/电针“委中穴”可逆转腰多裂肌损伤诱导的部分DEGs的表达。GO/KEGG富集分析提示,针刺“委中穴”可能通过调节先天免疫反应、趋化因子活性、趋化因子信号通路促进受损骨骼肌修复;电针“委中穴”可能通过调节NADH脱氢酶活性、氧化磷酸化及生热作用促进受损骨骼肌修复。(4)本研究发现针刺及电针可对UPR途径中IRE1、ATF6、PERK各分支中相关基因及蛋白进行不同程度调节,提示针刺对UPR相关通路的调节可能是针刺促进骨骼肌损伤修复的机制之一。