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结核病及耐药结核病的早发现、早治疗是提高结核病治愈率、降低死亡率的关键。然而基于固体培养的传统诊断方法检测周期长,一般为1-2个月,因此可能耽误患者的最佳治疗时机。随着分子生物学的迅速发展,出现了一批结核菌及耐药结核菌的快速基因型诊断技术;但是利用现有的异烟肼、链霉素相关耐药基因的常见突变位点(kat G、inh A、rps L、rrs)对临床异烟肼、链霉素耐药结核菌的检出率仅为60%~80%;因此发现新的耐药位点是提高基因型诊断检出率的基础和依据,并为改进和研发新的基因型诊断工具奠定基础,同时对全面研究耐异烟肼/链霉素结核分枝杆菌的耐药分子机制,以及发现新的药物作用靶点和研制新的抗结核药物具有深远意义。为此本研究首先评估基因型诊断技术的准确性,其次对预测出的新的耐药位点进行鉴定,最后通过控制单因素(药物)变量法,成功构建体外诱导耐异烟肼/链霉素的结核分枝杆菌模型,从而排除环境等因素对结核菌碱基突变的影响,达到有效筛查新耐药位点的目的。本研究的主要内容及研究结果如下:1、为评估实验室现有基因型诊断技术的准确性及最低检出限,并为制定合理的诊断路径提供依据。本试验对已知耐药表型的结核分枝杆菌进行浓度梯度倍比稀释后研究发现,Xpert MTB/RIF比基因芯片和Geno Type?MTBDRplus的检测灵敏度稍高,其检出下限同培养法相当(3×102个数/m L)。在MTB含量较高的情况下(>3×104个数/m L)基因型检测方法均能检出利福平或异烟肼耐药结核菌,因此基因型检测方法对结核菌耐药性的检测具有较高的准确性。2、发现异烟肼/链霉素耐药结核菌中新的耐药位点是提高其基因型诊断检出率的基础和依据,为此对129株结核分枝杆菌临床分离株进行PCR扩增并测序比对分析发现,异烟肼耐药结核菌中基因间区Rv1482c~Rv1483(1673425位点)碱基突变的检出率为17.78%(8/44);链霉素耐药结核菌中基因间区Rv1194c~Rv1195(1338631位点)碱基突变的检出率为11.11%(5/45)。表明基因间区Rv1482c~Rv1483、Rv1194c~Rv1195分别是异烟肼、链霉素耐药结核菌中新的耐药位点,并可提高临床异烟肼/链霉素耐药结核菌基因型诊断的检出率。3、为有效筛查异烟肼/链霉素耐药结核菌中新的潜在耐药位点,并为建立准确、高效的基因型诊断技术奠定基础。本试验构建了体外诱导耐异烟肼/链霉素的结核分枝杆菌模型,并通过分析比对诱导耐药株和未诱导对照株全基因组序列的差异,发现了7个新的潜在异烟肼耐药位点,8个新的潜在链霉素耐药位点,后续仍需对其进行验证。总之,本研究结果表明基因型检测方法是耐药结核病临床诊断不可或缺的辅助诊断技术,同时有效筛查出异烟肼/链霉素耐药结核菌中新的潜在耐药位点,可提高异烟肼/链霉素耐药结核菌基因型诊断的检出率,对进一步改进和研发耐药结核菌基因型快速诊断技术具有重要意义。