第一部分:蛋白酶活化受体2调控结直肠癌细胞Bcl-xL的分子机制和功能研究Bcl-xL是Bcl-2蛋白家族中的抗凋亡蛋白之一,在调控细胞凋亡、细胞自噬和肿瘤代谢等方面都具有重要作用。有大量研究报道Bcl-xL在结直肠癌中高表达,但是关于其在结直肠癌中高表达的分子机制却不明了。另一方面,肠道存在其特有的微环境,肠道中含有丰富的胰蛋白酶类,能够激活细胞膜上的一个七次跨膜的G蛋白偶联受体蛋白酶活化受体2(protease-activated receptor 2,PAR2)。本研究的目的是:明确PAR2信号是否调控Bcl-xL的表达,研究其调控的分子机制并初步探索其在结直肠癌治疗中潜在的应用价值。首先我们发现在多个结直肠癌的数据库和细胞系中Bcl-xL与PAR2的表达水平呈显著正相关。特异性激活PAR2信号通路可以显著上调多个细胞系中Bcl-xL的蛋白表达水平,而非mRNA水平。进一步的研究发现激活PAR2显著延长了 Bcl-xL蛋白的半衰期,而抑制该通路则显著增加了Bcl-xL蛋白的降解。此外,只有蛋白酶体抑制剂,而非溶酶体和caspase的抑制剂,可以阻断PAR2缺失导致的Bcl-xL蛋白的减少。后续的研究发现敲降PAR2显著增加了 E3连接酶RNF152的mRNA水平。重要的是,过表达RNF152明显加快Bcl-xL的降解并显著降低了 Bcl-xL的蛋白水平;而抑制RNF152能逆转PAR2敲降引起的Bcl-xL的降低。免疫共沉淀实验结果显示,RNF152与Bcl-xL之间存在相互作用,并且激活PAR2显著抑制这种相互作用。在结直肠癌临床样本中RNF152的表达水平显著下调并且与不良预后显著相关。在功能方面,抑制PAR2能显著增加EGFR-TKI(Gefitinib和AG1478)诱导的细胞凋亡,而且抑制RNF152能够逆转这种现象。在体内,用shRNA或者是PAR2的抑制剂抑制PAR2都能够显著增加Gefitinib对裸鼠移植瘤的抑制作用。综上所述,PAR2信号通过抑制泛素-蛋白酶体降解途径促进Bcl-xL蛋白的稳定性。鉴于PAR2以及激活PAR2的蛋白酶在肠道微环境中广泛存在,PAR2-RNF152-Bcl-xL信号轴可能是维持Bcl-xL在结直肠癌中高表达的重要机制之一。此外,抑制PAR2信号通路可能是克服结直肠癌患者对EGFR-TKI耐药的重要途径之一。第二部分:水飞蓟宾预防小鼠结肠炎相关结肠癌的机制研究水飞蓟宾(silibinin)是菊科植物水飞蓟的果实或者种子的总提取物中的主要有效成分。水飞蓟宾是一种低毒的具有化学预防作用的天然药物,在临床上作为保肝药物被广泛应用于治疗肝炎、肝硬化及代谢中毒性肝损伤等疾病。近年来越来越多的研究表明,水飞蓟宾能通过抑制肿瘤细胞增殖、促进细胞凋亡、抑制血管新生和炎症反应等机制在多种肿瘤中发挥抗肿瘤作用,包括结直肠癌。为了探索水飞蓟宾能否用于预防结肠炎相关结肠癌的发生,我们建立了氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)-葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导的结肠炎相关结肠癌小鼠模型,并用水飞蓟宾进行干预。结果发现,水飞蓟宾干预后显著抑制了小鼠结肠的瘤负荷和肿瘤大小,但是对小鼠结肠肿瘤的数目没有影响。进一步研究发现,水飞蓟宾显著抑制了 AOM-DSS诱导的结肠肿瘤细胞的增殖水平,然而并未显著改变细胞凋亡水平,以及促炎因子(COX-2、IL-6、IL-8和iNOS)、周期蛋白CyclinD1和血管内皮生长因子VEGF等mRNA的表达水平。体外研究发现水飞蓟宾直接诱导小鼠结肠癌细胞CT-26发生细胞周期G2/M阻滞。进一步的机制研究显示:水飞蓟宾显著降低去磷酸化酶Cdc25c的表达进而抑制CDK1的去磷酸化,而后者是G2/M阻滞的重要机制。综上所述,水飞蓟宾通过抑制去磷酸化酶Cdc25c的表达诱导细胞周期G2/M阻滞进而抑制AOM-DSS诱导的结肠炎相关结肠癌的生长,这为水飞蓟宾以后应用于结肠炎相关结直肠癌的预防提供了有力的理论依据。