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类萌发素蛋白(Germin-like proteins,GLPs)是与germin相似性达到30%到70%的蛋白。已有的报道表明该蛋白广泛存在于被子植物中,参与植物许多重要的生理过程,但关于其确切的生化和生理功能却知之甚少。为进一步探讨OsGLP1的生理功能及其作用的分子机制,本论文首先构建了过表达OsGLP1/OsGLP1-His的水稻植株及CRISPR/Cas9定点编辑的OsGLP1植株,然后分析了转基因植株表型及相关生理指标的变化,所得结果如下:(1)过量表达OsGLP1/OsGLP1-His水稻转基因植株的构建以水稻粳稻品种DongJing基因组的DNA为模板,PCR扩增目的片段,分别构建重组载体pOx-OsGLP1和一个带His蛋白纯化标签的重组载体pOx-OsGLP1-His。利用农杆菌介导法分别将上述两个载体转入水稻愈伤组织,成功获得过量表达OsGLP1的株系?个及过量表达OsGLP1-His的转基因株系3个。Western blotting分析表明转基因植株中的OsGLP1蛋白明显提高。(2)利用CRISPR/Cas9定点编辑技术构建OsGLP1突变的水稻转基因植株采用农杆菌介导法将pYLCRISPR/Cas9-OsGLP1载体成功转入DJ中,经潮霉素筛选获得10个转基因株系。T0代植株测序结果显示10个转基因株系中的OsGLP1均有突变,其中大多数植株为嵌合体和复等位突变,少数为杂合子和纯合子。在T1代,筛选到3个不含外源基因但OsGLP1已成功突变的转基因株系。(3)OsGLP1是一个热稳定性很高但不具有SOD活性的蛋白过量表达OsGLP1水稻植株叶片中的SOD活性并未提高,而OsGLP1突变植株叶片中的SOD活性反而升高。将过量表达OsGLP1水稻植株叶片蛋白粗提液在70℃加热60 min,或在85℃加热10 min,用Western bloting在上述上清液中仍可检测到OsGLP1,说明OsGLP1的热稳定性较高。将过量表达OsGLP1水稻植株和野生型植株DJ叶片中的蛋白粗提液在80℃加热10 min离心,取上清超滤浓缩后在Native-PAGE中分离,采用CBB染色法可观察到其比DJ明显多一条带,回收此带经SDS-PAGE分离,Western bloting检测杂到目的条带。但不管是采用比色法还是Native-PAGE胶上原位染色法,过量表达植株和野生型植株叶片中的SOD活性均无明显差异,因此水稻中的OsGLP1没有SOD活性。(4)OsGLP1突变导致水稻株高和分蘖数下降,叶片出现褐色斑点与野生型相比,Cas9-OsGLP1转基因植株表现出矮化、分蘖数减少、叶片出现棕褐色斑点的表型。DAB或NBT染色显示Cas9-OsGLP1转基因植株叶片中的H2O2和O2.-含量较野生型DJ和过表达OsGLP1水稻转基因植株低。MV处理显示Cas9-OsGLP1转基因植株较野生型DJ和过表达OsGLP1水稻转基因植株抗氧化胁迫能力更强。因此Cas9-OsGLP1转基因植株叶片上棕褐色斑点的形成可能与氧化胁迫无关。(5)OsGLP1的可能定位于细胞外基质中在水稻原生质体中OsGLP1定位在内质网上,但在烟草叶片中绿色荧光呈不连续状分布在烟草叶片细胞周围,因此OsGLP1极有可能定位在细胞外基质中。但是由于细胞膜与细胞壁并未分离,因此不能确定OsGLP1是在细胞外基质中,还是在细胞壁上。