目的本研究结合生物信息学分析、体内和体外实验,从临床标本、模型动物组织和细胞三个层面验证miR-423-5p促进气道和肺纤维化的作用,并探寻其下游调控靶点和可能作用机制。以期为进一步研究气道纤维化、肺纤维化的病理生理过程奠定基础,亦为临床干预气道和肺纤维化提供新的思路及可能治疗靶点。方法1.生物信息学分析:（1）数据下载:从美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）GEO公共数据库下载GSE75647的Series Matrix File数据文件,共7组转录组数据,包含对照组（n=3）,纤维化组（n=4）,用于探讨对照组与纤维化组两者之间的分子机制差异;（2）差异分析:我们使用Limma包计算对照组和纤维化组之间的差异基因,差异基因筛选条件为p＜0.05和|Log2FC|＞0.58;（3）基因本体论（Gene Ontology,GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）功能注释:使用Metascape对差异基因进行功能注释,探讨差异基因的功能相关性;（4）通过Cytoscape软件可视化生成蛋白相互作用网络（Protein-Protein Interaction Network,PPI）,探讨miRNAs与靶基因表达的相关性。2.临床标本收集:根据纳排标准,选取气道对照组和气道纤维化组患者各10例,肺对照组17例和肺纤维化组患者12例,收集患者临床资料和标本以备下一步研究。每位患者均已知情同意,研究方案获得医院伦理委员会批准。HE、Masson染色观察临床标本组织结构病理改变和胶原纤维沉积情况;RT-qPCR检测临床标本miR-218-5p、miR-373-3p和miR-423-5p水平,筛选对照组和纤维化组表达差异最大的Micro RNA;检测TGF-β1、上皮间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transformation,EMT）相关基因（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、α-SMA）m RNA水平。免疫组化检测各组临床标本TGF-β1、FOXP4、PI3K、AKT、m TOR和EMT相关蛋白表达。3.动物实验:构建硬质尼龙刷刮擦机械损伤诱导的大鼠气道纤维化模型和气管滴注博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型,在体应用miR-423-5p抑制剂miR-423-5p antagomir对纤维化模型实验鼠miR-423-5p水平进行干预。气道纤维化模型大鼠、肺纤维化模型小鼠按照随机数字表法分别随机分成三组:模型对照组、miR-423-5p antagomir阴性对照（miR-423-5p antagomir NC）组、miR-423-5p antagomir组。miR-423-5p antagomir NC组和miR-423-5p antagomir组气道纤维化模型大鼠,于第7天按80mg/kg剂量分别气管滴注miR-423-5p antagomir NC、miR-423-5p antagomir,其余两组大鼠气管滴注相同剂量的生理盐水,于第8天处死大鼠留取气管组织。miR-423-5p antagomir NC组和miR-423-5p antagomir组肺纤维化模型小鼠于第18、19、20天尾静脉注射miR-423-5p antagomir NC、miR-423-5p antagomir,剂量同气道纤维化模型大鼠,其余两组小鼠尾静脉注射相同剂量的生理盐水,于第21天处死小鼠留取肺组织。HE、Masson染色分别观察气道和肺组织病理变化和胶原纤维沉积情况;RT-qPCR检测组织miR-423-5p、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin m RNA水平;WB检测组织E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达。4.细胞实验:以人支气管上皮细胞BEAS-2B和人II型肺泡上皮细胞A549作为研究对象。（1）细胞功能学实验:用10ng/ml TGF-β1刺激BEAS-2B、A549细胞24h构建EMT模型,miR-423-5p Mimics和miR-423-5p Inhibitor转染EMT模型细胞以调控miR-423-5p表达。BEAS-2B和A549细胞均分六组:空白对照组、TGF-β1干预组、miR-423-5p Mimics NC+TGF-β1（Mimics NC+TGF-β1）组、miR-423-5p Mimics+TGF-β1（Mimics+TGF-β1）组、miR-423-5p Inhibitor NC+TGF-β1（Inhibitor NC+TGF-β1）组和miR-423-5p Inhibitor+TGF-β1（Inhibitor+TGF-β1）组。划痕实验和Transwell迁移实验观察细胞迁移能力;RT-qPCR检测细胞miR-423-5p、EMT相关基因（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、α-SMA）m RNA水平;WB检测细胞EMT相关蛋白（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、α-SMA）和PI3K/P-PI3K、AKT/P-AKT、m TOR/P-m TOR蛋白表达;ELISA检测细胞EMT相关蛋白表达;免疫荧光定位细胞E-cadherin、Vimentin、α-SMA蛋白。利用生物信息学预测、荧光原位杂交技术、RNA pull-down实验、双荧光素酶报告实验和RT-qPCR、WB、ELISA、免疫荧光等方法验证miR-423-5p与FOXP4结合情况,探讨miR-423-5p对FOXP4的调控作用。（2）细胞功能回复实验:miR-423-5p Inhibitor和si FOXP4转染BEAS-2B、A549细胞（EMT模型细胞）以调控miR-423-5p、FOXP4表达。BEAS-2B和A549细胞均分四组:空白对照组、Inhibitor NC+TGF-β1组、Inhibitor+TGF-β1+si NC组、Inhibitor+TGF-β1+si FOXP4组。划痕实验和Transwell迁移实验观察细胞迁移能力;RT-qPCR检测细胞miR-423-5p、FOXP4、EMT相关基因m RNA水平;WB检测细胞EMT相关蛋白和FOXP4、PI3K/P-PI3K、AKT/P-AKT、m TOR/P-m TOR蛋白表达;ELISA检测细胞FOXP4、EMT相关蛋白表达;免疫荧光观察细胞FOXP4、E-cadherin、Vimentin、α-SMA蛋白定位。结果1.生信分析共筛选出3个差异基因,其中表达上调基因1个（miR-423-5p）,表达下调基因2个（miR-218-5p、miR-373-3p）。GO富集显示差异Micro RNAs的生物学功能主要集中在纤维化过程相关调控、细胞内吞作用及细胞分裂分化调节;分子功能主要集中在转录因子、泛素特异性蛋白酶及受体信号复合物支架。KEGG信号通路主要集中在跨膜受体蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶信号通路及MAPK信号通路。使用Cytoscape构建miRNA-m RNA相互作用网络图,结果显示hsa-miR-373-3p、hsa-miR-423-5p与多个m RNA有结合位点,提示以上两者miRNAs可调控多个m RNA基因表达,在调控网络中起重要作用。2.正常对照组和气道、肺纤维化组患者年龄、性别、吸烟情况、体质指数等均无统计学差异,证明两组实验数据具有可比性。HE、Masson染色结果显示,与正常对照组相比,气道、肺纤维化组组织结构破坏严重且纤维化面积大、密度高。RT-qPCR结果表明与正常对照组相比,气道、肺纤维化组miR-423-5p、miR-218-5p和miR-373-3p RNA水平均存在差异,其中miR-423-5p水平升高最为显著（结合前述PPI网络图结果,因此本实验以miR-423-5p作为研究靶基因）;纤维化组TGF-β1、N-cadherin、Vimentin、α-SMA m RNA水平明显增高,E-cadherin m RNA水平下降。免疫组化证实气道、肺纤维化组TGF-β1、N-cadherin、Vimentin、α-SMA、PI3K、AKT、m TOR蛋白表达较正常对照组升高,而FOXP4、E-cadherin蛋白表达降低。实验结果具有统计学差异（P＜0.05）。3.动物组织病理（联合HE、Masson染色）结果显示,模型对照组、miR-423-5p antagomir NC组较正常对照组、miR-423-5p antagomir组,气道、肺纤维化组织结构破坏严重,且纤维化面积更大、程度更深;RT-qPCR结果显示模型对照组、miR-423-5p antagomir NC组与其对照组相比,miR-423-5p、N-cadherin和Vimentin m RNA水平明显增高,E-cadherin m RNA水平下降;联合WB和免疫组化实验表明模型对照组、miR-423-5p antagomir NC组N-cadherin、Vimentin、PI3K、AKT、m TOR蛋白表达升高,E-cadherin蛋白表达降低。实验结果具有统计学差异（P＜0.05）。4.细胞划痕和Transwell迁移实验表明,空白对照组与TGF-β1干预组、Mimics NC+TGF-β1组与Mimics+TGF-β1组、Inhibitor NC+TGF-β1组与Inhibitor+TGF-β1组相比,TGF-β1干预组、Mimics+TGF-β1组、Inhibitor NC+TGF-β1组细胞迁移能力显著增强。RT-qPCR结果显示空白对照组与TGF-β1干预组、Mimics NC+TGF-β1组与Mimics+TGF-β1组、Inhibitor NC+TGF-β1组与Inhibitor+TGF-β1组相比,TGF-β1干预组、Mimics+TGF-β1组、Inhibitor NC+TGF-β1组E-cadherin m RNA水平明显降低,miR-423-5p、N-cadherin、Vimentin、α-SMA m RNA水平显著增高。WB和ELISA实验结果证实TGF-β1干预组、Mimics+TGF-β1组、inhibitor NC+TGF-β1组E-cadherin蛋白表达明显降低,N-cadherin、Vimentin、α-SMA、P-PI3K、P-AKT、P-m TOR蛋白表达显著增高;实验结果具有统计学差异（P＜0.05）。免疫荧光结果显示E-cadherin蛋白定位于细胞膜,Vimentin和α-SMA蛋白定位于细胞浆。荧光强度表明空白对照组与TGF-β1干预组、Mimics NC+TGF-β1组与Mimics+TGF-β1组、Inhibitor NC+TGF-β1组与Inhibitor+TGF-β1组相比,TGF-β1干预组、Mimics+TGF-β1组、Inhibitor NC+TGF-β1组E-cadherin荧光强度减弱,Vimentin、α-SMA荧光强度增强。免疫荧光结果与各组细胞EMT相关蛋白表达高低一致。5.生物信息学网站Targetscan和miRDB均预测到miR-423-5p与FOXP4有5个7结合,3个6结合位点。荧光原位杂交技术显示miR-423-5p位于细胞浆或者细胞核,FOXP4 m RNA定位于细胞核;共定位提示两者RNA存在结合。RNA pull-down实验显示与input-NC组相比,input-FOXP4组miR-423-5p m RNA水平明显升高,说明miR-423-5p与FOXP4两者结合（P＜0.05）。双荧光素酶报告实验显示与NC组相比,hsa-miR-423-5p显著下调h-FOXP4-3UTR-WT luciferase活性（P＜0.001）。RT-qPCR、免疫组化、WB、ELISA、免疫荧光等检测结果均证实,上调miR-423-5p表达可明显抑制FOXP4水平（P＜0.05）,免疫荧光显示FOXP4蛋白表达定位于细胞核。6.划痕和Transwell迁移实验显示,与空白对照组相比,Inhibitor NC+TGF-β1组细胞迁移能力显著增加;与Inhibitor NC+TGF-β1组相比,Inhibitor+TGF-β1+si NC组细胞迁移能力减弱;Inhibitor+TGF-β1+si FOXP4组较Inhibitor+TGF-β1+si NC组细胞迁移能力明显增强。RT-qPCR结果表明与空白对照组相比,Inhibitor NC+TGF-β1组FOXP4、E-cadherin m RNA水平明显降低,N-cadherin、Vimentin、α-SMA m RNA水平显著增高;与Inhibitor NC+TGF-β1组相比,Inhibitor+TGF-β1+si NC组FOXP4、E-cadherin m RNA水平增高,N-cadherin、Vimentin、α-SMA m RNA水平降低;与Inhibitor+TGF-β1+si NC组相比,Inhibitor+TGF-β1+si FOXP4组FOXP4、E-cadherin m RNA水平明显降低,N-cadherin、Vimentin、α-SMA m RNA水平显著增高。WB和ELISA结果均证实与空白对照组相比,Inhibitor NC+TGF-β1组FOXP4、E-cadherin蛋白水平明显降低,N-cadherin、Vimentin、α-SMA、P-PI3K、P-AKT、P-m TOR蛋白水平显著增高;与Inhibitor NC+TGF-β1组相比,Inhibitor+TGF-β1+si NC组FOXP4、E-cadherin蛋白水平增高,N-cadherin、Vimentin、α-SMA、P-PI3K、P-AKT、P-m TOR蛋白水平降低;与Inhibitor+TGF-β1+si FOXP4组相比,Inhibitor+TGF-β1+si NC组FOXP4、E-cadherin蛋白水平明显降低,N-cadherin、Vimentin、α-SMA、P-PI3K、P-AKT、P-m TOR蛋白水平显著升高;实验结果具有统计学差异（P＜0.05）。荧光强度显示Inhibitor NC+TGF-β1组与空白对照组相比,FOXP4、E-cadherin荧光强度减弱,Vimentin、α-SMA荧光强度增强;Inhibitor+TGF-β1+si NC组较Inhibitor NC+TGF-β1组FOXP4、E-cadherin荧光强度增强,Vimentin、α-SMA荧光强度减弱;与Inhibitor+TGF-β1+si NC组相比,Inhibitor+TGF-β1+si FOXP4组FOXP4、E-cadherin荧光强度减弱,Vimentin、α-SMA荧光强度增强。荧光强度与各组细胞EMT相关蛋白表达高低一致。结论1.miR-423-5p在气道、肺纤维化患者临床标本和气道、肺纤维化实验鼠组织及上皮细胞EMT模型中表达升高,提示其参与气道、肺纤维化和上皮细胞EMT的病理生理过程。2.miR-423-5p促进气道和肺纤维化发生发展,其分子机制与miR-423-5p诱导EMT有关。3.FOXP4为miR-423-5p下游调控基因;miR-423-5p通过与FOXP4的m RNA 3’-UTR区直接结合靶向抑制FOXP4表达,诱导BEAS-2B和A549细胞EMT。4.PI3K/AKT/m TOR信号通路激活参与miR-423-5p靶向调控FOXP4基因介导的气道和肺纤维化过程。5.miR-423-5p、FOXP4基因和PI3K/AKT/m TOR信号通路有望成为临床预防和干预气道、肺纤维化的潜在靶点。