乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,全世界每年约有150万妇女发生乳腺癌,约50万人死于该病,而且乳腺癌发病率每年有0.2%-0.8%的上升,存在明显地区差异,如北美、北欧地区发病率约为亚、非、拉美地区的4倍。我国虽是乳腺癌的低发地区,但发病率近年来呈逐年上升趋势,尤其在沪、京、津及沿海等乳腺癌高发地区,其发病率已高居女性肿瘤的第一位。目前,乳腺癌的临床治疗方法主要有手术治疗、化疗、放疗、免疫治疗中医药治疗等。尽管这些方法对乳腺癌的治疗有显著改善,提高了乳腺癌患者的生存时间,但仅有不超过半数的原位乳腺癌患者受益于助化疗,大多数肿瘤转移病人最终因耐药而使病程发展；而全身放化疗还会导致急慢性毒副作用,如充血性心力衰竭、神经性疾病、不育症和骨质疏松症等。近年来出现的肿瘤分子靶向治疗有别十以上治疗方法,其优越性在于分子靶向药物通常仅与相应的靶分子结合,通过直接影响靶分子的功能,或通过本身带有的物理或化学效应分子来达到杀伤或抑制目标细胞增殖或转移的作用。由于分子靶向药物具有较高的选择性和靶向性,可以有效地杀伤或抑制靶细胞,对正常组织细胞不产生或仅产生较小的毒副作用。因此,研制分子靶向药物成为肿；瘤临床研究的热点。人滋养层细胞表面抗原2(human trophoblast cell surface antigen 2.Trop-2)是山TACSTD2基因编码的细胞表面糖蛋白。大量临床研究和文献报道表明,Trop-2在乳腺癌、结肠癌、胃癌、肺癌、前列腺癌、子宫癌和胰腺癌等上皮癌中过表达,而在成年人正常组织中很少表达或不表达；Trop-2在肿瘤组织中的过表达与患者的预后不良和癌细胞的转移密切相关,同时影响患者的总生存率。因此,Trop-2已成为肿瘤分子靶向治疗中引人注目的靶标。本课题通过分析Trop-2与我国乳腺癌发生的相关性,评价Trop-2作为乳腺癌靶向治疗分子靶标的可行性；通过大容量人源噬菌体抗体库的筛选,制备人源抗Trop-2的基因工程抗体Fab片段；在分析抗Trop-2 Fab抗体特性的基础上,分别在细胞水平和动物体内,评价抗Trop-2 Fab抗体靶向治疗乳腺癌的疗效。研究目的：1.用定量PCR和免疫组化等方法,分析Trop-2的表达与乳腺癌的发生发展及预后的相关性；2.以Trop-2抗原和乳腺癌细胞为靶标,筛选人源噬菌体抗体库,制备抗Trop-2基因工程抗体Fab,分析Fab抗体的免疫学特性,并大量表达与纯化Fab；3.在细胞水平上分析人源抗Trop-2 Fab抗体对乳腺癌细胞生物学特性的影响及相关分子机制；4.在动物模型中观察抗Trop-2 Fab抗体对乳腺癌生长的影响及其相关分子机制。研究方法：1.用实时定量PCR方法检测15例乳腺癌组织15例癌旁组织,同时用免疫组化方法检测Trop-2在82例乳腺癌组织和癌旁组织中的表达,通过卡方检验、单因索和多因素Cox回归分析模型,探讨Trop-2的表达与乳腺癌临床病理分期、预后的关系：2.利用噬菌体抗体库技术,以稳定表达Trop-2的人乳腺癌SK-BR-3细胞为阳性筛选细胞、不表达Trop-2的NIH3T3细胞作为阴性筛选细胞,筛选本实验室构建的大容量人源噬菌体抗体库；用真核表达的Trop-2蛋白筛选次级抗体库；通过phage ELISA检测,筛选能够与Trop-2蛋白结合的特异性噬菌体克隆。核酸序列分析后,正确的克隆用于Fab表达与与纯化,用SDS-PAGE和Western blot进行检测,通过ELISA、IP-MS、FACS和IF等方法,分析Fab的免疫学特性,并大量表达与纯化Fab；3.用MTT法检测抗Trop-2 Fab抗体对五株乳腺癌细胞系生长的影响,根据结果,选择一种细胞系作为后续实验研究对象。在2-D培养条件下,利用伤口愈合实验,测定抗Trop-2 Fab抗体对乳腺癌细胞迁移能力的影响；直接免疫荧光检测抗Trop-2 Fab抗体对乳腺癌细胞的的F-actin表达变化；用DAP1染色观察乳腺癌细胞的核质变化；用流式细胞术分析乳腺癌细胞的细胞凋亡和细胞周期改变；用Transewell法检测乳腺癌细胞侵袭能力的变化。在3-D培养条件下观察抗Trop-2 Fab抗体对肿瘤球体的形成、体积变化及F-actin表达的影响。4.建立乳腺癌移植瘤动物模型,在体内分析抗Trop-2 Fab抗体对乳腺癌生长的抑制作用；并用免疫组化方法观察裸鼠体内肿瘤组织中细胞凋亡相关因子Caspase-3、Bcl-2和βax表达的变化。研究结果：1.用实时定量PCR检测15例乳腺癌患者的新鲜组织标本和相对应的15例癌旁组织,结果显示Trop-2 mRNA在乳腺癌组织中的含量比癌旁组织高2.74倍；免疫组化检测82例乳腺癌组织和癌旁乳腺组织,结果显示,Trop-2在乳腺癌组织中过表达,阳性率为56.10%；乳腺癌中Trop-2的表达与肿瘤组织分化程度、p53表达、Cyclin D1表达、淋巴结转移、肿瘤远处转移、肿瘤TNM分期有关；乳腺癌患者7年生存率与Trop-2的高表达、Cyclin D1阳性表达、Trop-2与Cyclin Dl的共表达、淋巴结转移相关。多因素Cox回归分析模型提示,Trop-2高表达、Cyclin Dl阳性表达及淋巴结转移是乳腺癌患者生存的独立预后因素。Kaplan-Meier生存曲线显示,本组乳腺癌组织Trop-2高表达、Cyclin D1阳性淋巴结转移的患者生存时间,明显低于Trop-2低表达、Cyclin Dl阴性、无淋巴结转移的乳腺癌患者的生存时间。2.经过三轮组细胞筛选和两轮Trop-2抗原的固相筛选及phage ELISA鉴定,筛选出效价较高的9个阳性克隆；经测序分析,仅有一种单一的核酸序列,命名为Fab01。诱导表达后,经SDS-PAGE和Western blot分析,分别在28kD和32kD处呈现两条与预期大小相近的蛋白条带。FACS检测结果显示,Fab01能够与Trop-2阳性细胞SK-BR-3特异性结合,但不结合Trop-2阴性表达的NIH3T3细胞；荧光染色结果显示Fab01与SK-BR-3结合后,阳性信号主要存在于细胞膜表明该抗体能够与细胞表面天然构象的Trop-2蛋白特异性结合；免疫共沉淀和质谱分析结果显示,Fab01结合的蛋白为Trop-2,其亲和力为6.27×10-8M。3.MTT检测结果表明,Fab01能够明显抑制人乳腺癌细胞的生长；用Fab01处理2-D培养的乳腺癌细胞MDA-MB-231,其IC50为20.9μg/ml。伤口愈合实验表明,Fab01能够抑制MDA-MB-231细胞的迁移；直接免疫荧光检测发现,Fab01处理细胞F-actin的表达下调和结果改变,提示Fab01可能通过影响细胞骨架的表达与重建而抑制乳腺癌细胞的迁移能力；流式细胞术的结果显示细胞阻滞在G1/S期；凋亡的细胞数目增加；间接免疫荧光结果显示,Fab01处理后的细胞Bax表达上调而Bcl-2表达出现下调；Fab01作用于3-D培养的多细胞肿瘤球体,能够降低细胞间的粘附,减缓细胞的集聚,使最初球体形成减小,导致球体体积的增长速度变慢,同时发现F-actin的表达量下降。4.构建乳腺癌移植瘤动物模型,分析抗Trop-2 Fab抗体对乳腺癌细胞增殖的影响。研究结果表明,高剂量的抗Trop-2 Fab抗体对乳腺癌细胞的增殖具有显著的抑制作用,肿瘤抑制率达35.21%；免疫组化分析显示,治疗组和对照组中Caspase-3、Bax、Bcl-2表达有显著性差异,Caspase-3、Bax在高剂量抗体组中的表达比空白对照组明显增多,而Bcl-2则呈减少的趋势。研究结论：1. Trop-2的过表达与我国乳腺癌的发生、发展及预后有显著关系；2.通过筛选人源噬菌体抗体库,制备了以株高亲和力的人源抗Trop-2 Fab抗体,该抗体能够与表达Trop-2的乳腺癌细胞株特异性结合,3.单独使用抗Trop-2 Fab可抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移；在乳腺癌移植瘤动物模型中,Fab能够抑制肿瘤的生长。4.抗Trop-2 Fab抗体主要通过调控细胞周期的变化和诱导细胞调亡,抑制肿瘤细胞的生长；通过下调细胞F-actin的表达和干扰重排,抑制细胞的转移。