论文部分内容阅读
白血病抑制因子是白介素-6家族中的一种多效性细胞因子,可以多种方式作用于不同类型的细胞,其最显著的作用是可以抑制胚胎干细胞的分化并保持其增殖能力。转录因子Oct4属于POU家族中的第V亚族,由POU5fl基因编码,由未分化的胚胎干细胞表达,其表达水平决定了胚胎干细胞的分化方向。Oct4还是制备诱导多能干细胞的关键因子。本研究的目的是克隆鸡LIF、POUV基因、对其进行生物信息学分析、构建其原核表达载体并进行诱导表达。实验1.以成年鸡肝脏组织的总RNA为模板,经RT-PCR技术扩增出鸡LIF基因,将其与pEASY-T1克隆载体连接,获得重组质粒pEASY-T1-chLIF,测序并进行生物信息学分析,酶切重组质粒pEASY-T1-chLIF,获得正确克隆的鸡LIF基因,将其与pET-30a原核表达载体连接,获得重组质粒pET-30a-chLIF。结果表明：（1）构建了重组质粒pEASY-T1-chLIF和pET-30a-chLIF;克隆的鸡LIF基因全长564bp,共编码188个氨基酸,与GenBank上公布的Gallus LIF （XM418264）相比,核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别为99.8%、99.5%,无插入或缺失变异。（2）多物种LIF序列的比对结果表明,鸡LIF与哺乳动物的LIF保守性较低,LIF基因存在种属特异性。（3）鸡LIF蛋白理论分子量为20.885KDa,等电点为9.342。（4）鸡LIF蛋白是亲水性蛋白,没有跨膜结构域。（5）鸡LIF蛋白的二级结构由48.66%的无规则卷曲、43.32%的α-螺旋和8.02%的伸展串组成,三级结构由4个通过环连接的螺旋组成。实验2.实验方法基本同上,不同的是作为模板的总RNA是从新出壳的小公鸡睾丸组织中提取的,使用的克隆载体是pMD18-T,最后获得了重组质粒pMD18-T-chPOUV和pET-30a-chPOUV。将重组质粒pET-30a-chPOUV转化入大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导其表达,通过SDS-PAGE和Westren blot鉴定其表达的融合蛋白。结果表明：（1）构建了重组质粒pMD18-T-chPOUV和pET-30a-chPOUV；克隆的鸡POUV基因完整的开放阅读框全长888bp,共编码295个氨基酸。与GenBank上公布的Gallus POUV （NM001110178）相比,核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别为99.4%、98.6%。克隆的鸡POUV基因全序列无插入或缺失变异。（2）多物种POUV序列的比对结果表明,POUV基因存在种属特异性,鸡POUV与哺乳动物的POUV有一段高度保守的氨基酸序列位于鸡POUV的第83～227位氨基酸,可能是鸡POUV蛋白的功能决定域。（3）鸡POUV蛋白理论分子量为33.229KDa,等电点为9.791。（4）鸡POUV蛋白是亲水性蛋白,没有跨膜结构域,其氨基酸序列的N端没有信号肽。（5）鸡POUV蛋白的二级结构由53.22%的无规则卷曲、33.56%的α-螺旋和13.22%的伸展串组成,三级结构由两个多螺旋结构中间通过环连接组成。（6） SDS-PAGE和Western blot鉴定结果表明重组质粒pET30a-chPOUV在大肠杆菌中成功表达,表达的融合蛋白His-chPOUV相对分子量约为41kDa。总而言之,本实验克隆了鸡LIF和POUV基因,并构建了相应的原核表达载体,且对POUV进行了原核表达,为进一步纯化鸡LIF蛋白,制备鸡POUV多克隆或单克隆抗体,进而用于鸡胚胎干细胞培养和诱导的多能性干细胞研究奠定了基础。