论文部分内容阅读
罗丹明B(Rhodamine B, RB)是一种人工合成的三苯甲烷类碱性染料,因其具有鲜桃红色曾用作食品添加剂,但是后来有实验证明RB具有潜在的毒性、致癌和致突变性,目前已禁止用作食品染色剂。检测RB残留可采用传统的仪器检测方法,主要有分光光度法、高效液相色谱检测法、超高效色谱检测法、液相色谱-质谱联用法、荧光探针法以及表面增强拉曼光谱技术等。仪器检测法需要贵重的仪器设备、较复杂的样品处理过程以及专门的相关技术人员,这些不利因素使这些检测方法不适用于现场高通量的样品检测。免疫学检测方法基于抗原抗体特异性结合而具有高度的选择性和灵敏度,其检测方法简便、高效并且便于携带,适合大批量样品的快速筛选。本实验以N-羟基琥珀酰亚胺活性脂法(NHS)合成RB完全抗原,经过透析、鉴定后免疫BALB/c小鼠,利用单克隆抗体技术、酶联免疫吸附测定(ELSIA)及小鼠腹水制备等技术,制备出针对RB特异性强、效价高的抗体,并在此基础上建立间接竞争ELSIA法和胶体金免疫层析试纸条检测方法。1.RB完全抗原的合成及鉴定。RB属于半抗原,其分子结构上本身含有羧基,通过N-羟基琥珀酰亚胺活性脂法,将RB分子上的羧基与载体蛋白(BSA, OVA)分子上的氨基偶联起来,形成稳定的酰胺键,即合成完全抗原。完全抗原经紫外光谱扫描法和SDS-PAGE凝胶电泳法鉴定,初步判定偶联成功。最终完全抗原经免疫、融合及ELISA测定,表明两种抗原的制备是成功的。利用BCA法测得RB-BSA和RB-OVA蛋白浓度分别为5,4mg/mL和3.4mg/mL。2.RB单抗制备。采用实验室常规免疫方案免疫BALB/c小鼠,用合成的人工抗原RB-BSA作为免疫原,以RB-OVA为包被原。五免后第7天小鼠断尾采血,测血清效价及抑制情况,血清效价达1：16000以上。利用细胞融合技术、ELISA筛选方法和有限稀释法进行亚克隆获得三株可持续分泌针对RB抗体的杂交瘤细胞株2D1、4C3和7F1l。采用小鼠体内诱生法制备了抗RB单克隆抗体的腹水,其蛋白浓度分别为20.6mg/mL、19.1mg/mL和22.4mg/m L;效价分别为16000、64000和512000。采用HiTrap Protein G HP纯化柱纯化7F11腹水,纯化后的腹水经SDS-PAGE鉴定杂蛋白明显减少。交叉实验结果表明,该单抗与罗丹明6G、罗丹明123、苯酚红、副品红、中性红、曙红Y、橙黄Ⅱ、甲基橙、结晶紫几乎没有交叉反应,而对RB的抑制率为100%。3.ELISA检测方法的建立。利用纯化后的7F11单克隆抗体建立检测RB残留的间接竞争ELISA方法。包被原最佳稀释浓度1：2000,纯化后7F11抗体的工作浓度1：64000,RB浓度在6～5000ng/mL时,标准曲线线性良好,线性方程为y=0.3056x-0.2357(R2=0.9903),IC50为254.5ng/L,LOD低于6ng/mL,LOQ为12.5ng/mL。4.腊肉中RB添加回收实验对腊肉进行添加回收实验,腊肉样品需要经过前处理后才能用于实验测定。实验结果显示样品处理液稀释16倍以上时,样品的基质干扰基本消失。在12～5000ng/mL范围内,曲线标准方程：y=0.3372x-0.3620,相关系数R2=9913,IC50为359ng/mL,LOD低于12ng/mL, LOQ为23.4ng/mL。用50、300、800ng/mL的RB标准液做添加回收实验,经检测腊肉样品回收率在82%-93%之间。5.RB胶体金免疫层析试纸条的研制采用柠檬酸三钠还原氯金酸方法制备了3种不同粒径的胶体金,分别进行颜色观察和紫外扫描曲线,结果表明,31nm胶体金颗粒可用于标记抗体。通过实验摸索确定了胶体金标记抗体的最适pH为8.1,最适蛋白质浓度为5.3μg/mL。利用实验室摸索的最佳条件制得免疫胶体金,采用低温超速离心法进行纯化。金标抗体最佳稀释度选择为1：1.5,最佳喷涂量为30μL/cm。硝酸纤维素膜质控线兔抗鼠IgG最佳喷量为0.7μL/cm,检测线RB-OVA最佳喷涂量为06μL/cm。制得的免疫层析试纸条检测限为400ng/mL。