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研究背景瘢痕疙瘩是机体对损伤的异常愈合反应，以成纤维细胞的增殖异常和细胞外基质成分的过度堆积为主要特征，其发病机制至今不明。在治疗上尚无特效方法，是目前整形外科研究的热点和难点问题。近年来的研究表明核因子-κB（nuclear factor-κB NF-κB）信号转导通路贯穿于创伤修复与愈合的整个生物学过程，它是信号从细胞表面转导到细胞内部的重要传递者，参与细胞生长、发育、凋亡等多种生理功能，并在细胞恶性转化、纤维化等方面起重要作用。越来越多的研究表明：许多疾病的发生和发展都与NF-κB的过度活化有关，以NF-κB为作用靶点治疗或缓解疾病已经成为研究热点。以NF-κB为作用靶点治疗或缓解疾病已经成为研究热点。阿司匹林是重要的非甾体类抗炎药NSAIDs，主要通过抑制环氧化酶（COX）进而抑制前列腺素E2的合成，控制炎症反应。最近研究证实，阿司匹林可以呈剂量和时间依赖性抑制NF-κB的活化，具有治疗和预防肿瘤的作用。研究表明瘢痕疙瘩在临床特征、基因突变、细胞因子与受体及治疗方法等方面与肿瘤具有相似性，正常皮肤和瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞在基因表达和细胞凋亡方面有显著的差异，瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞具有较强的增殖能力和耐受细胞死亡的能力——即凋亡抗性。目前，有关NF-κB信号转导通路在瘢痕疙瘩发病机制中的作用、阿司匹林抑制NF-κB的活化对瘢痕疙瘩形成的影响尚未见文献报道。目的本研究拟利用临床收集的瘢痕疙瘩以及正常皮肤标本，观察NF-κB信号传导通路关键基因p65、其上游抑制基因IκB-α以及下游靶基因cyclinD1在组织中的静息状态表达水平是否存在差异。选择在瘢痕疙瘩发病中起主要作用的成纤维细胞作为进一步观察对象，原代培养成纤维细胞，利用细胞外源性细胞因子—肿瘤坏死因子-α（TNF-α）作为NF-κB信号传导通路的活化剂，观察TNF-α对瘢痕疙瘩成纤维细胞（KFs）的增殖的影响；对NF-κB信号转导通路p65、IκB-α以及cyclinD1动态变化规律的影响；并与正常皮肤成纤维细胞（NFs）相比较。选择阿司匹林作为NF-κB信号转导通路的有效阻滞剂，采用不同浓度阿司匹林预处理KFs后，再给予TNF-α刺激细胞，观察对NF-κB信号转导通路上、下游相关基因p65、IκB-α以及cyclinD1的影响；对KFs增殖、细胞周期和凋亡的影响。方法收集临床标本，包括15例瘢痕疙瘩组织以及10例正常皮肤。采用组织免疫组织化学方法分析标本中NF-κB p65蛋白表达；提取mRNA以及核蛋白，实时荧光定量RT-PCR检测组织中IκB-α的转录水平以及TransAMTM NF-κB p65试剂盒检测NF-κB p65的DNA结合活性水平；利用Western blot技术检测细胞周期蛋白D1（cyclinD1）的蛋白水平。组织块法培养瘢痕疙瘩以及正常皮肤成纤维细胞；取第4-8代细胞用于实验。分别应用10ng/ml、50ng/ml以及100ng/ml TNF-α处理瘢痕疙瘩成纤维细胞24h、48h、72h、96h以及120h，MTT法观察TNF-α对细胞增殖的影响；应用50ng/ml TNF-α刺激成纤维细胞15min、30min、1h、2h以及4h，免疫荧光技术观察NF-αB P65和IκB-α在静息状态和TNF-a刺激后在成纤维细胞的亚细胞分布；收集成纤维细胞，提取细胞核蛋白以及细胞浆蛋白，用TransAMTM NF-κB p65试剂盒检测细胞核NF-κB p65的DNA结合活性，Western blot技术检测细胞浆IκB-α蛋白表达。取原代培养的KFs，分为空白对照组、50ng/mlTNF-α处理组、1.0mM、2.5mM、5.0mM以及10.0mM阿司匹林预作用2h后合并TNF-α再处理组，作用时间为15min，抽提细胞浆与细胞核蛋白，应用Western Blot技术检测细胞浆IκB-α以及p-IκBα蛋白表达水平，TransAMTM NF-κB p65 Kit试剂盒检测细胞核NF-κBp65 DNA结合活性水平；同样上述分组而TNF-α再作用时间改为1h，免疫荧光技术观察NF-κB P65及其上游抑制因子IκB-α在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的亚细胞分布；1.0mM、2.5mM、5.0mM、10.0mM阿司匹林预作用细胞2h后TNF-α再分别处理24h、48h、72h、96h、120h，MTT法检测阿司匹林的抗成纤维细胞增殖效应；1.0mM、5.0mM、10.0mM阿司匹林预作用细胞2h后TNF-α再处理24h，应用流式细胞仪检测不同处理组瘢痕疙瘩成纤维细胞的凋亡率以及对细胞周期的影响。结果瘢痕疙瘩组织在静息状态下存在着NF-κB的持续活化，表现为NF-κB p65在瘢痕疙瘩中蛋白表达以及DNA结合活性高于正常皮肤，NF-κB通路上游抑制因子IκB-α在瘢痕疙瘩中转录水平低于正常皮肤组织，下游靶基因cyclinD1蛋白表达水平高于正常皮肤。不同浓度TNF-α处理瘢痕疙瘩成纤维细胞，在低浓度时随着浓度增加具有促进其增殖的作用，最大刺激增殖浓度为50ng/ml TNF-α，当浓度达到100ng/ml TNF-α时，则出现抑制其生长作用；TNF-α刺激成纤维细胞后，细胞浆p-IκB-α蛋白水平在刺激后15min升高至最高值，4h基本检测不到；细胞浆IκB-α蛋白水平在刺激后15min降至最低值，4h基本接近正常；NF-κB P65从细胞浆转移至细胞核；NF-κB p65 DNA结合活性水平在刺激后1h达到高峰，4h接近正常；在各个时间点，IκB-α蛋白表达水平以及NF-κB p65 DNA结合活性水平的变化幅度KFs较NFs剧烈，对TNF-α的刺激更为敏感。阿司匹林预处理后联合TNF-α作用于成纤维细胞，可以阻止细胞浆IκB-α的磷酸化和降解，抑制NF-κB P65的细胞核移位，降低NF-κB p65 DNA结合活性，表现为阿司匹林呈剂量和时间依赖性促进KFs TNF-α诱导的凋亡，使KFs滞留于G0期，抑制KFs的增殖。结论1．NF-κB信号转导通路的上游抑制因子IκB-α在瘢痕疙瘩的表达低于正常皮肤对照组，而NF-κB p65 DNA蛋白结合活性以及其下游靶基因cyclnD1蛋白表达水平高于正常皮肤对照组，这种异常暗示NF-κB信号转导通路可能参与了瘢痕疙瘩的发生机制。2．KFs对不同浓度的TNF-α的反应不一致，低浓度TNF-α可刺激KFs增殖，高浓度TNF-α可抑制其增殖。3．与NFs相比较，KFs对于低浓度的TNF-α的刺激反应更为强烈，表现在NF-κB信号通路相关基因的变化幅度较大，这种差异有可能是造成KFs异常增殖和凋亡抗性产生的原因。4．阿司匹林可以有效阻止TNF-α诱导的NF-κB上游抑制因子IκB-α的磷酸化和降解，阻止NF-κB p65的核移位。5．阿司匹林可以促进KFs凋亡，抑制其增殖，使细胞停滞于细胞周期G0期，其作用强度呈时间—剂量依赖性。