平面培养模型是研究肝癌的发生发展和转移复发机制的较好模型,三维培养模型在平面培养模型的基础上更接近在体状况。目前还缺乏在三维状态下研究肝癌侵袭、转移等分子机制的实验模型。本研究应用了旋转壁式生物反应器和PLGA支架材料,旋转壁式反应器具有微重力和低剪切力的特点,PLGA生物支架能更好地支撑细胞形成的类组织结构。本文首先将人高转移性肝癌细胞MHCC97H利用生物反应器进行有PLGA支架的三维培养,MHCC97H细胞和支架粘附形成团块,随着培养时间的延长,细胞团聚集体更加紧密,且表面光滑,行成高转移潜能肝癌类组织体；组化显示,细胞紧密排列,电镜超微结构显示类组织体细胞具有了组织细胞特有的一些结构,例如桥粒和紧密连接。临床上葡萄糖、LDH、ALB、γ-GT和AFP常用来评价肝组织功能。与平面培养细胞相比,类组织体形成过程中葡萄糖消耗下降,LDH分泌增加,显示在类组织体形成过程中葡萄糖分解增强而葡萄糖氧化受到了抑制；类组织体形成过程中,y-GT和AFP的分泌也明显高于平面培养细胞,这些结果显示类组织体获得了HCC特征性酶(蛋白)产生和分泌的能力,并且结果同HCC病人血清病理特征一致。与平面培养细胞相比,流式细胞技术显示类组织体中较低的S和G2-M期细胞,说明其中的细胞生长和增殖不活跃。对类组织体HCC特征基因(AFP, ALB)、粘附分子基因(ICAM1,CD29)以及转移相关基因(CD44,E-cadherin, MMP9, MMP2)的检测发现三维培养的不同时段尤其是第15天,这些基因的表达明显不同于平面培养细胞,ICAM1和CD29的上调表达说明类组织体呈现了明显的细胞相互作用和连接的组织特征；白蛋白和AFP的表达增加和上述培养上清中的结果-致,说明类组织体部分具有了肝脏和肝癌组织的特征。肝癌转移相关基因CD44,MMP9,ICAM1,CD29表达增加和E-钙粘素的表达降低同临床转移性HCC特征相似。这些结果显示该模型不仅是HCC模型也和肝癌高转移潜能相关。免疫组织化学方法对ICAM1、CD29和AFP在类组织体中的表达检测结果显示这些蛋白相对平面培养细胞具有强表达,这些蛋白表达的模式与上述基因表达的模式一致。类组织体原位种植裸鼠肝脏形成的肿瘤组织结构呈现典型的HCC病理组织特征,HCC转移相关蛋白CK7,CK8,CK19和MMP9在再生瘤中具有高表达,证明再生瘤具有高转移潜能且存在肝内播散；在所有待测裸鼠的肺组织连续切片病理分析中,均发现有癌细胞转移,说明发生了肝癌肺转移,证实类组织体具有肝内播散和远端转移的能力。以上结果表明本文成功地建立了体外人高转移潜能肝癌类组织体模型,该模型建立所使用的类组织体原位移植形成肿瘤的方法可能成为建立动物模型的新方法,该模型也可能在药物筛选等方面具有良好应用。本研究还使用定量蛋白质组学方法对平面培养细胞和类组织体的蛋白组学性质也进行了分析,表明三维状态下的肝癌细胞在众多方面明显不同于两维的人肝癌细胞系。细胞三维形态结构及其周边组织结构对于肿瘤细胞恶性生物学功能的维持十分重要。肿瘤转移的靶器官环境对肿瘤细胞的侵袭和转移病理机制也有重要影响。肺转移是肝癌远端转移的主要形式。为了构建肝癌肺侵袭实验模型,体外再现癌细胞从黏附、侵袭到肺内癌巢形成的病理全过程,解决三维状态下缺少理想肝癌侵袭转移实验模型问题及肝癌侵袭转移“过程”关键蛋白筛查缺少理想标本实验体系问题,也为了深入解析在三维状态下肿瘤细胞侵袭转移恶性生物学特征的分子机制,在高转移潜能人肝癌细胞类组织体研究的基础之上,研究首先对不同转移潜能的人肝癌细胞Hep3B和MHCC97H形成的类组织体进行了比较定量蛋白组学研究,获得三维培养状态下与转移关联的基因,并检测了其中部分基因在肝癌肺侵袭过程中的表达。接下来将高转移潜能人肝癌细胞系与裸鼠肺组织块共同旋转培养,建立了肝癌肺侵袭实验模型,对该病理过程中不同时段的混合类组织体进行比较定量蛋白质组学筛查,以期获得肺侵袭过程关联蛋白分子,研究其在侵袭转移中的生物学功能,明确其参与肝癌肺侵袭转移的分子机制；在发现的侵袭转移关联蛋白中,对冠蛋白1B (coronin 1B)的研究发现,该蛋白受抑制的细胞的运动速度比对照细胞降低了,而经肺组织粗提物诱导之后,该细胞的运动速度又明显增加了。说明靶器官性质和侵袭转移关联蛋白共同决定细胞的运动潜能。本研究建立的高转移潜能肝癌类组织模型以及肝癌肺侵袭模型是在三维状态下易于直接检测和观察的体外实验模型,相对平面培养模型更能模拟肝癌组织特征,相对动物模型,具有省时、简化的优势,并且排除了动物个体差异对实验结果的影响。第一部分新的体外高转移潜能肝癌类组织体模型的建立在三维状态下研究肝癌转移机制的模型缺乏,为了建立一个体外高转移潜能肝癌类组织体,更好地在三维状态下研究肝癌转移的机制,也为构建肝癌肺侵袭模型奠定基础,本研究首先使用RWV生物反应器,将MHCC97H细胞和PLGA支架混合旋转培养形成类组织体,使用形态观察、组织化学染色以及电镜观察等方法研究该类组织体的宏观和微观的形态；培养的类组织体随着培养时间的增加逐渐由松散、体积大变得紧密和体积小,形态学的观察显示该类组织体与平面培养细胞具有明显不同,出现了组织特有结构；使用酶联免疫标记等方法研究该类组织体形成过程中的蛋白产生和分泌的情况、葡萄糖代谢的情况；白蛋白等一些组织特有的酶、癌症和转移相关的酶的表达与平面培养细胞不同,更接近实体肿瘤；对一些组织、癌症和转移相关性基因表达分析也显示出了同样的结果；使用流式细胞仪技术对细胞的生长和凋亡的研究显示类组织体细胞的凋亡和增殖不活跃；使用原位种植裸鼠肝脏类组织体实验验证该模型的成瘤性和转移性,结果发现类组织体能在肝脏形成肿瘤,并且发生了肝内播散和肺转移,虽然已经有很多类组织体模型的相关报道,但是对成瘤性和转移性检测的研究在国内外还未见报道。所有的结果都显示该模型比单层培养肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞更好地模拟了转移性人肝癌组织的主要性质,三维状态下的肝癌细胞在形态结构、基因表达、蛋白分泌、成瘤转移等方面明显不同于两维的人肝癌细胞系,和已有的临床肝癌组织病理特征相似,说明成功建立了高转移潜能人肝癌类组织体模型。研究结果可能在肝癌研究、抗癌药物筛选以及肝癌动物模型的建立方面有良好应用,同时也表明HCC细胞三维形态结构及其周边组织结构对于肿瘤细胞恶性生物学功能的维持十分重要。第二部分肝癌肺侵袭模型建立及肺侵袭过程关联蛋白功能解析为了建立在三维状态下的肝癌肺侵袭模型,为探讨肝癌肺侵袭的分子机制提供良好模型,并对该模型培养不同时间蛋白(过程蛋白)进行蛋白组学分析,进而筛查和肺侵袭相关联的蛋白,并进一步对部分关联蛋白进行验证和功能研究。本研究首先由MHCC97H类组织体和Hep3B类组织体的iTRAQ定量蛋白质组学比较得到一些和转移相关的基因；检测了其中部分基因在建立的肝癌肺侵袭模型培养不同时间的表达。建立肝癌肺侵袭模型培养初期,MHCC97H细胞聚集粘附于肺组织块周围,并有轻微肝组织浸润侵袭。接着癌细胞肺组织的侵袭变得越来越明显,培养至第16天,发现癌细胞已进入肺组织并形成癌巢。因此建立了宜于直接检测、观察的肝癌肺侵袭实验模型,模拟出肝癌细胞从黏附、侵袭到肺内癌巢形成全过程。对该肺侵袭模型培养产物的转移相关基因的分析发现,MHCC97H细胞的转移潜能随着培养时间的延长增加了；用iTRAQ定量蛋白质组学的方法对该模型过程蛋白进行了动态的分析,发现了一些和肺侵袭相关联的差异蛋白,对部分差异蛋白的定量PCR验证了这些蛋白在mRNA水平的表达。慢病毒载体介导的RNA干扰对过程差异蛋白CORO1B进行了抑制,CORO1B受到抑制的细胞运动潜能明显降低了,经过肺组织粗提物的诱导,运动潜能又有增加。本研究成功地构建了体外肝癌肺侵袭实验模型,解决了三维状态下缺少理想肝癌肺侵袭实验模型问题及肝癌侵袭转移“过程”关键蛋白筛查缺少理想标本实验体系问题,有助于深入解析三维状态下肿瘤细胞侵袭转移恶性生物学特征的分子机制；获得了与肝癌肺侵袭“过程”关联的差异蛋白,并对持续上调的差异蛋白CORO1B的生物学功能进行初步探讨,发现CORO1B影响细胞运动,肺组织粗提物也影响细胞运动,说明靶器官微环境与关联蛋白的协同决定细胞运动潜能。结论1.体外成功建立三维转移性人肝癌类组织体模型,其在组织形态结构、特征基因表达、蛋白分泌情况、动物成瘤及转移能力等方面具有更接近体内转移性肝癌实体瘤生长病理特征。2.三维状态下的肝癌细胞在形态结构、基因表达、蛋白分泌、成瘤转移等方面明显不同于两维的人肝癌细胞系。3.细胞三维形态结构及其周边组织结构对于肿瘤细胞恶性生物学功能的维持十分重要。4.成功地构建出宜于直接检测、观察的肝癌肺侵袭实验模型,模拟出肝癌细胞从黏附、侵袭到肺内癌巢形成全过程,解决三维状态下缺少理想肝癌肺侵袭实验模型问题及肝癌侵袭转移“过程”关键蛋白筛查缺少理想标本实验体系问题,有助于深入解析三维状态下肿瘤细胞侵袭转移恶性生物学特征的分子机制。5.获得与肝癌肺侵袭“过程”关联的差异蛋白,并对持续上调的差异蛋白CORO1B的生物学功能进行初步探讨,发现CORO1B表达降低的MHCC97H细胞的运动潜能降低,而在肺组织粗提物的诱导环境中,COROIB表达降低的MHCC97H细胞的运动潜能同样降低,但与未加肺组织粗提物的MHCC97H比,其运动能力明显改善,说明靶器官微环境与关联蛋白的协同决定细胞运动能力潜能。创新点1.建立了具有创新意义的体外三维转移性肝癌类组织模型,为深入解析和发现三维状态下肝癌细胞恶性生物学分子机制及转移新机制打开思路,同时也为解决体外研究肝癌组织细胞病理特征缺少理想实验模型及肝癌放疗、化疗缺少理想体外实验评估体系等问题提供可能。2.构建出宜于直接检测、观察的肝癌肺侵袭实验模型,模拟出肝癌细胞从黏附、侵袭到肺内癌巢形成全过程,解决三维状态下缺少理想肝癌肺侵袭实验模型问题及肝癌侵袭转移“过程”关键蛋白筛查缺少理想标本实验体系问题,有助于深入解析三维状态下肿瘤细胞侵袭转移恶性生物学特征的分子机制。潜在应用价值1.高转移潜能人肝癌细胞类组织在模拟体内转移性肝癌生物学特征方面明显优于两维平板培养的肿瘤细胞,提供易于重复研究又相对简化的肝癌生长的特定体外模拟培养环境,有助于肿瘤细胞的恶性生物学行为的实验解析,可解决体外研究肝癌组织细胞病理特征缺少理想实验模型问题及肝癌临床药物治疗缺少理想体外实验评估体系问题,同时该发明的应用也简单易行。2.肝癌肺侵袭模型形成过程中,分别获取不同时间点的混合类组织标本,进行肝侵袭转移过程关联蛋白、过程关联基因的筛查及动态分子病理、动态蛋白质组、动态基因组分析等。3.在肝癌肺侵袭模型形成过程中,将与粘附、侵袭转移关联的待评价药物依据不同剂量,直接溶入或加入培养液中混匀,通过对不同时程混合类组织体生长及病理特征评估变化来对药物的疗效进行体外组织水平实验评估。4.作为一种新型肝癌肺侵袭实验模型,可用于三维状态下肝癌细胞侵袭、转移的恶性生物学行为分子解析,及肝癌组织水平的体外基础实验研究。