第一部分术后分期为pT3N0M0的食管鳞癌患者CD8+/FOXP3+比值以及PD-L1的表达与预后的相关性研究研究背景尽管近年来食管鳞癌的多学科治疗手段正逐步完善,但其生存提高仍然有限。TNM分期仍然是食管鳞癌主要预后因素,但相同病理分期尤其是中期患者预后差异较大,部分患者可获得长期的生存,而另一部分患者由于快速复发而死亡。第7版AJCC(American Joint Committee on Cancer,美国联合癌症委员会)分期系统中新增肿瘤部位以及肿瘤分化程度作为分期的因素。但目前的分期标准仍然仅仅描述肿瘤负荷,并没有提供任何关于食管鳞癌局部增殖的微环境的信息。近年来由于免疫检查点抑制剂取得的革命性的突破,以PD-1(programmed-death 1,程序性细胞死亡蛋白-1)/PD-L1(programmed death-ligand 1,程序性细胞死亡蛋白配体-1)为代表的免疫检查点以及TILs(tumor-infiltrating lymphocytes,肿瘤浸润淋巴细胞)浸润正日益得到人们的关注。但是,目前关于ESCC免疫微环境对患者预后的影响研究较少,且彼此之间的结论仍存在争议。本研究通过检测术后标本CD8、FOXP3(forkhead box protein 3,叉头盒蛋白3)以及PD-L1的表达,进而研究CD8、FOXP3以及PD-L1对术后分期为 pT3N0M0(pathological stage T3N0M0,病理分期 T3N0M0)食管鳞癌生存的预测作用,探索免疫检查点抑制剂在这部分食管鳞癌中的治疗价值。方法本研究回顾性分析2005年6月至2013年6月于我院行食管癌根治术后的食管鳞癌患者,入组标准:术后病理确诊为食管鳞状细胞癌且病理分期为pT3NOM0;术前排除远处转移;术前未进行新辅助治疗;术后未进行辅助治疗。排除标准:术前进行新辅助治疗(化疗或放疗);术前已存在远处转移;围手术期死亡;姑息手术;切缘阳性;手术清扫的淋巴结<12枚;术后进行辅助治疗(化疗或放疗);肿瘤组织标本缺乏;既往有其他恶性肿瘤史;诊断时存在其他部位的恶性肿瘤;患有免疫系统疾病以及服用免疫调节药物等;无随访资料。随访截止至2017年12月30日。OS(overall survival,总生存)定义为自手术时间到死亡时间或最后一次已知随访时间。DFS(disease-freesurvival,无病生存)定义为手术时间至术后复发或随访截止的时间。该项临床研究经过我院伦理委员会审核通过。采用免疫组织化学方法检测PD-L1在肿瘤组织中的表达情况以及CD8+TILs、FOXP3+TILs浸润情况。根据染色强度评估PD-L1表达状态,具体为:肿瘤细胞或间质细胞的胞膜或胞浆着色者为阳性;两者胞浆以及胞膜均不着色者为阴性。同时选取了 10例组织样本,采用qRT-PCR(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,定量逆转录聚合酶链式反应)的方法检测肿瘤组织PD-L1 mRNA表达,与免疫组化结果相对照。CD8+或者FOXP3+TILs浸润情况通过选取5个浸润最多且不重叠的高倍视野下阳性淋巴细胞的平均数进行评估,CD8+/FOXP3+比值定义为CD8+TILs计数除以FOXP3+TILs 计数。CD8+TILs、FOXP3+TILs 以及 CD8+/FOXP3+比值以中位数为界,高于中位数者记为高水平,低于中位数者记为低水平。采用 SPSS 24.0 软件(IBM SPSS,Chicago,Illinois,USA)进行统计分析。免疫指标与临床病理特征的关系采用卡方检验或Fisher精确检验。Spearman相关性检测用来分析肿瘤浸润免疫细胞亚群之间的关联。单因素生存分析采用Kaplan-Meier方法,多因素生存分析采用Cox比例风险模型。所有p值均为双侧检验,p<0.05为有统计学差异的检验水准。结果1.患者基本临床病理特征共入组151例食管鳞癌根治性切除术后病理分期为pT3N0M0的患者。在随访期间,121例患者(80.1%)出现复发,102例(67.55%)死亡。中位DFS、OS分别为37.7个月及49.5个月。2.CD8+TILs、FOXP3+TILs的分布及PD-L1表达与临床病理因素之间的关系CD8+TILs、FOXP3+TILs大多数以“灶状分布”的方式聚集于癌巢周围的间质,且两者的浸润呈中度相关(r=0.554;p<0.001)。PD-LI的表达主要定位在细胞膜以及细胞质,呈现聚集性或者散发性染色特征(43.0%表达阳性),其免疫组化表达(阳性以及阴性)与qRT-PCR的结果有较强的相关性以及一致性(r=0.853,p=0.002)。PD-LI的表达高低与CD8+TILs浸润程度呈反比(r=-0.610,p<0.001)。另外,PD-L1 表达与高龄(>60,p=0.034)、肿瘤长度较长(>4cm,p=0.001)、分化程度差(p=0.002)以及肿瘤复发(p=0.001)相关,而CD8+TILs、FOXP3+TILs浸润程度以及CD8+/FOXP3+比值与临床病理因素无相关性。3.患者预后因素分析单因素分析结果显示FOXP3+TILs以及CD8+TILs的浸润程度与患者预后的关系无明显统计学差异。但是,单因素以及多因素分析结果均显示CD8+/FOXP3+比值以及 PD-L1 表达为 DFS(HR 2.133,95%CI 1.472-3.089,p<0.001;HR 0.620,95%CI 0.426-0.902,p=0.012;respectively)以及 OS(HR 2.492,95%CI 1.662-3.737,p<0.001;HR 0.562,95%CI 0.375-0.841,p=0.005;respectively)的独立预后因素。另外,肿瘤分化程度在单因素分析中与OS相关(p=0.040),但在多因素分析中并不是OS独立预后因素。亚组分析显示,PD-L1表达低且CD8+/FOXP3+比值高水平的患者相较于其他三组预后最好(p<0.001)。而且,在肿瘤长度相似的高分化以及中低分化组中PD-L1阳性的患者 DFS(p 分别为 0.028、0.004)以及 OS(p 分别为 0.003、0.008)较 PD-L1阴性者差。结论该研究显示pT3N0M0食管癌患者的预后与CD8+/FOXP3+比值以及PD-L1水平密切相关。而且,这部分食管癌患者PD-L1过表达可能是由于内源性机制导致。这些信息对食管癌患者的分层以及指导免疫检查点抑制剂在食管癌中的应用有一定的价值。第二部分肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)与肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的比值以及外周血淋巴细胞单核细胞比值(LMR)对pT3N0M0食管鳞癌患者预后意义的探讨研究背景食管鳞癌作为我国高发的恶性肿瘤类型,具有高复发率、高致死率的特征。尽管近年来食管癌多学科综合治疗方式的推行改善了患者的生存,但是食管癌的高复发率以及同一分期下患者预后的差异已成为新的挑战。过去的研究着重于原癌基因、抑癌基因的功能改变以及表观遗传学的变化在正常细胞向肿瘤细胞转变过程中发挥的作用。然而随着免疫治疗的兴起,通过改善以慢性炎症、免疫抑制、促进肿瘤血管形成为特征的肿瘤微环境来抑制肿瘤生长的理念越来越深入人心。很多研究已经证实TAM(tumor-associated macrophage,肿瘤相关巨噬细胞)、TILs在肿瘤微环境上述三个特征中发挥着重要作用。与此同时,越来越多的研究报道全身免疫炎症反应(血液中淋巴细胞、单核细胞及其比值)与肿瘤患者预后相关。但是将肿瘤局部免疫与全身免疫状态联合的研究较少。本研究探讨pT3N0M0食管鳞癌患者术前外周血LMR(lymphocyte-monocyte ratio,淋巴单核细胞比值)与术后手术标本TILs/TAM比值之间的关系及其预后意义。方法本研究回顾性分析我院2006年1月至2013年]月治疗的术前无远处转移、未经术前新辅助放化疗且根治术后病理分期为pT3N0M0的食管鳞癌患者。分析患者病历资料,记录患者临床病理特征、术前1周内ALC(absolutelymphocyte count,全血淋巴细胞计数)以及AMC(absolute lymphocyte count,全血单核细胞计数)、术后治疗及复发情况等,并计算LMR。该项临床研究经过我院伦理委员会审核通过。通过免疫组化方法检测CD8+TILs、CD4+TILs、CD45RO+TILs以及CD68+TAM的浸润情况,由两位病理科医生对上述细胞间质浸润百分数进行半定量评分(5%为最小的间隔),计算TILs/TAM比值,并根据各指标的中位值将患者分为高组以及低组。采用SPSS 24.0软件进行统计学分析。Spearman相关性分析评价指标之间的相关性。卡方检验以及Fisher检验用来比较高组与低组患者组间临床病理特征的差异。单因素分析采用Kaplan-Meier方法,多因素分析采用COX回归风险比例模型。p<0.05(双侧)为有统计学差异的检验水准。结果入组237例术后分期为pT3N0M0的ESCC患者,其中单独手术患者108例(45.57%),根据术后病理结果,9例脉管受累,6例侵犯神经。随访终止日期为2017年6月30日,其中185例(78.06%)在最后一次随访之前死亡,191例(80.59%)在随访期间出现复发。全组患者中位OS 51.0个月,中位DFS 38.5个月。CD45RO+TILs、CD4+TILs、CD8+TILs 以及 CD68+TAM 在食管癌患者组织中均有浸润,且以间质浸润为主。各个血液指标以及肿瘤浸润免疫细胞亚群与临床病理因素的相关性如下:肿瘤长度较长(>4cm)、肿瘤分化程度较低的患者AMC水平较高(p分别为0.047、0.003);CD68+TAM浸润程度与肿瘤长度以及脉管受累之间明显相关(p分别为0.041、0.019)。除此之外,其他单个指标与临床病理因素之间均无相关性。另外,LMR与肿瘤分化程度以及肿瘤长度相关(p分别为0.001、0.021),LMR较低的患者,肿瘤分化程度较低且肿瘤长度偏长;CD45RO/CD68比值以及CD4/CD68比值与肿瘤分化程度(p分别为0.026、0.016)及复发状态(p分别为0.001、0.023)也有明显相关性。采用Spearman相关性分析检测血液学指标与肿瘤浸润免疫指标之间的相关性发现:患者AMC水平不仅与肿瘤原发灶TAM的浸润水平呈正相关(r=0.308,p<0.001)且与CD8+TILs的浸润水平呈弱负相关(r=-0.288,p<0.001);ALC水平不仅与CD4+TILs的浸润水平呈弱正相关(r=0.162,p=0.015),而且与TAM 浸润水平呈弱负相关(r=-0.158,p=0.017);LMR 与 CD8/CD68、CD4/CD68以及 CD45RO/CD68 均呈正相关(r=0.400、0.308、0.232,所有 p<0.001)。单因素分析显示各个免疫细胞亚群浸润密度(CD4+TILs、CD8+TILs、CD45RO+TILs和CD68+TAM)以及血液指标(ALC和AMC)与预后之间均无相关性。而除CD4/CD68比值以外,CD45RO/CD68比值以及CD8/CD68比值均为 OS(分别为 p<0.001,p=0.005)、DFS(p 分别为 0.001、0.018)的预后影响因素。LMR亦为OS的预后影响因素(p=0.032)。多因素分析显示,CD45RO/CD68 比值无论作为分类型变量(HR(0.691,95%CI 0.513-0.931,p=0.015;HR 0.687,95%CI 0.510-0.937,p=0.017)还是连续型变量(HR 0.886,95%CI 0.798-0.984,p=0.024;HR 0.884,95%CI 0.795-0.983,p=0.023)均为患者DFS、OS的独立预后因素,而LMR在多因素分析中并不是独立的预后影响因素。结论该项研究中,我们发现在根治术后分期为pT3N0M0的食管癌患者中CD45RO/CD68比值的预后价值高于LMR,CD45RO/CD68比值可作为未经术前新辅助放化疗且根治术后分期为pT3N0M0的食管癌患者的独立的预后指标。需要大样本研究来进一步确定CD45RO/CD68比值的预测作用。