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目的:慢性肾脏病(Chronic Kidney disease,CKD)患者死亡的首要病因是心血管疾病(Cardiovascular Disease,CVD),血管钙化是导致CKD患者CVD发病率和死亡率增加的关键环节,CKD患者的血管钙化主要发生在血管中膜。血管中膜的主要成分是血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cells,VSMCs),研究发现,维生素K2可以抑制血管中膜钙化,但其具体机制尚不明确。为了探讨维生素K2对血管中膜钙化的影响及作用机制,本实验以高磷诱导的VSMCs钙化为模型,观察了维生素K2对其核心结合因子α1(Core factor of alpha 1,Cbfα1)m RNA及蛋白和骨形态发生蛋白2(Bone morphogenetic protein 2,BMP-2)、SMAD1、SMAD7、Axl(Anexelekto)、B-细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)基因m RNA的表达变化以及细胞凋亡的影响。方法:1运用胸主动脉组织块贴壁法原代培养获取VSMCs,进行形态学及免疫细胞鉴定。2实验分组:将VSMCs随机分为正常对照组、高磷组干预组、维生素K2干预组(10μmol/L)、维生素K2干预组(25μmol/L)及维生素K2干预组(50μmol/L),阴性对照组采用低糖DMEM含10%胎牛血清的正常培养基培养,高磷组在正常培养基的基础上加入10 mmol/L的β-甘油磷酸制成高磷培养基培养,维生素K2干预组在上述高磷培养基的基础上加入维生素K2,使维生素K2的终浓度分别为10μmol/L、25μmol/L和50μmol/L。3钙化检测:VSMCs的钙化通过茜素红染色来检测,并用比色法检测其钙含量。4运用RT-PCR方法观察了不同浓度维生素K2对VSMCs中核心结合因子α1(Core factor of alpha 1,Cbfα1)m RNA及蛋白,骨形态发生蛋白2(Bone morphogenetic protein 2,BMP-2)、SMAD1、SMAD7、Axl(Anexelekto)、B-细胞淋巴瘤/白血病-2(B-celllymphoma/leukemia-2,Bcl-2)基因m RNA表达水平的影响。5运用Western-blot方法观察了不同浓度维生素K2对VSMCs中Cbfα1蛋白表达水平的影响。6运用流式细胞仪检测细胞凋亡率:先以0.25%胰酶消化收集的各组细胞,再用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次,将细胞重悬于70%乙醇中固定24h后,加入适量PI染液混匀,室温15 min后上机。7统计学方法:实验所取得的数据均用均数±标准差(±S)表示,采用SPSS13.0软件进行统计分析,组间的均数比较采用单因素方差分析(ANOVA),两两比较用SNK(Student-Newman-Keuls)检验,结果以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1 VSMCs原代培养:大鼠VSMCs的获取采用胸主动脉组织块贴壁培养法,一般情况下大约3-4d后即可见少许细胞爬出,形态为长梭形,排列较分散,约6-7d后细胞数目逐渐增多,铺满大部分瓶底。当80%-90%的瓶底面积铺满细胞后,便可进行传代培养,传代后的细胞最初近似为圆形,贴壁后其逐渐变为梭形或星型,有突起,细胞胞浆丰富,核大呈椭圆形,典型的呈现为“峰—谷”样交互重叠生长。通过免疫细胞化学法检测α-平滑肌肌动蛋白抗体(α-SMA actin),其为平滑肌细胞特异性的抗体,出现棕黄色的免疫反应产物在细胞胞浆强表达,即为阳性结果。几乎所有细胞均在细胞胞浆强表达。2维生素K2对高磷诱导的大鼠VSMCs钙化的影响:培养至第14天时茜素红染色结果显示,高磷组的橘红色矿化结节明显多于正常对照组;与高磷组相比,维生素K2干预组的橘红色矿化结节减少,且随维生素K2浓度的增高,橘红色矿化结节越来越少。钙含量测定结果与茜素红染色结果基本一致。3维生素K2对高磷诱导的大鼠VSMCs的BMP通路的影响:RT-PCR法观察结果显示,与正常对照组相比,高磷组的BMP-2和SMAD1m RNA表达明显增高(P<0.05),而维生素K2干预组的BMP-2和SMAD1m RNA表达随浓度增高而逐渐降低(P<0.05)。高磷组的SMAD7m RNA表达明显降低(P<0.05),而维生素K2干预组的SMAD7m RNA表达随浓度增高而逐渐升高(P<0.05)。4维生素K2对高磷诱导的大鼠VSMCs凋亡的影响:PI染色结合流式细胞仪检测结果显示,与正常对照组相比,高磷干预组细胞凋亡率显著增加(P<0.05);与高磷干预组相比,维生素K2各剂量干预组细胞凋亡率均显著降低(P<0.05)。RT-PCR法研究结果显示,与正常对照组相比,高磷组Axl m RNA表达明显减弱(P<0.05),维生素K2干预组的Axl m RNA表达增加,且随维生素K2浓度的增高,Axl m RNA表达逐渐增高,以50μmol/L维生素K2组达最高(见图3)。而Bcl-2的表达各组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1本课题采用胸主动脉组织块贴壁法成功地培养了大鼠VSMCs,为VSMCs原代培养搭建了一个平台。2维生素K2可以抑制高磷诱导的VSMCs的血管钙化。3维生素K2抑制VSMCs的血管钙化的机制,一方面与维生素K2抑制BMP信号通路相关基因的表达,进而抑制了血管平滑肌细胞成骨成软骨样表型转化有关;另一方面与维生素K2的抗凋亡作用有关。