病毒是一类严重危害人类身体健康的病原微生物,能够引起一系列危害人类身体健康的疾病,小至普通感冒,引起身体不适;大至急性感染,危及生命,更有甚者引起高死亡率的地区流行乃至全球流行性疾病。对引起疾病的病毒进行灵敏、快速、有效的检测和鉴定对于指导病毒性疾病的控制和治疗至关重要,因此,对于病毒检测手段的开发以及平台的建立一直以来都备受关注。传统的检测方法要么耗时费力,要么具有极高的专业及设备要求等缺点,而病毒诱导报告基因表达的细胞系能很好的解决上述遇到的病毒检测的问题,同时还能够应用于更灵敏的病毒滴度测定及抗病毒药物的筛选等。本论文主要尝试着构建杆状病毒、流感病毒及新疆出血热病毒诱导报告基因表达的细胞系,在论文的最后一章我们完成了一株新分离的发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒基因组克隆的构建及测序工作,以及一些相关蛋白免疫学功能的初步探讨。　　 第一章:文献综述。概括介绍了用于病毒诱导报告基因表达细胞系的构建原理和方法,目前已有的相关研究进展,并对本论文的研究对象杆状病毒、流感病毒、新疆出血热病毒及发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒进行了简要的介绍,同时也分别介绍了相应部分的研究目的和意义。　　 第二章:杆状病毒诱导报告基因表达细胞系Sf9-P的构建。本章我们在瞬时表达载体质粒pIZ/V5上将报告基因增强型的绿色荧光蛋白(EGFP)基因置于杆状病毒极晚期基因启动子多角体蛋白基因启动子(Pph)下,构建了报告质粒pIZPphE。将质粒pIZPphE转染苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒Autographa californica(Ac)MNPV敏感细胞系Sf9后,经质粒本身所携带的抗生素抗性基因Zeocin的筛选得到了经AcMNPV或相关的重组病毒感染后诱导表达绿色荧光的报告细胞系Sf9-P。在杆状病毒感染sfg-P后由于Pph被激活而表达EGFP,在荧光显微镜下观察将产生绿色荧光。较之目前的通过观察细胞病变来测定病毒滴度的方法,该细胞系能将测定滴度的时问由7天观察结果提前到3天观察结果,且灵敏度也有所提高。此细胞系能更为准确且方便的对杆状病毒进行病毒滴度的测定。　　 第三章:A型流感病毒诱导报告基因表达细胞系的构建。本章节我们开展了使用流感病毒诱导报告基因表达的方式检测A型流感病毒复制的研究。报告基因(红色荧光蛋白mCherry或绿色荧光蛋白EGFP)的开放阅读框两端引入了流感病毒A/WSN/33核蛋白NP片段的非编码区(经修饰),然后再将整个嵌合基因片段置于人RNA聚合酶Ⅰ启动子和鼠RNA聚合酶Ⅰ终止子的转录调控下,我们将此构建的质粒命名为pDPI-mCherry/pDPI-EGFP。将质粒转染293细胞后再辅以A型流感病毒PR8超感染6h后即可检测到绿色荧光EGFP的产生,红色荧光mCherry也在病毒超感染8h后可被观察到。这种方法不但能够快速且敏感的检测到流感病毒的复制,而且能够用于病毒滴度的计算以及抗病毒药物活性测定等方面的研究。随后我们也尝试了细胞系的筛选工作,但还未获得成功。　　 第四章:新疆出血热病毒诱导表达的报告质粒的构建。本章节我们开展了使用病毒诱导报告基因表达的方式检测新疆出血热病毒(XHFV)复制的研究。报告基因(绿色荧光蛋白EGFP)的开放阅读框两端引入了新疆出血热病毒基因组不同片段来源不同长度的非编码区,然后再将这整个报告基因片段置于人RNA聚合酶T启动子和鼠RNA聚合酶T终止子的转录调控下,由此构建了XHFV诱导表达的报告质粒。当我们将报告质粒转染293T细胞并用病毒进行超感染后荧光强度与荧光细胞量跟对照组(转染了报告质粒但没有用XHFV感染)相比并没有显著性的差别,表明此方法未获得成功。而且我们发现当在EGFP两端加入的UTR区达到一定长度时,即使是在没有病毒超感染的情况下仍然会有荧光的产生,该结果提示XHFV各片段UTR序列携带有目前还不为我们所知的内部核糖体识别信号的序列信息。　　 第五章:新布尼亚病毒基因组序列测定及其蛋白免疫功能研究。发热伴血小板减少综合征(SFTS)是一种巾新型布尼亚病毒SFTSV引起的新发传染性疾病,自2009在我国发病以来导致了数百人的住院治疗,平均致死率高达12%。本章我们完成了在河南省新分离到的一株发热伴血小板减少综合征病毒(PhlebovirusWCH-2011/HN/China/isolate97)的基因组克隆及序列测定工作。并利用双荧光素酶报告系统开展了该病毒编码的一些相关蛋白免疫学功能的初步探讨,实验证明SFTSV S片段编码的非结构蛋白NS能够很好的抑制仙台病毒(SeV)诱导的IFN-β和ISRE启动子的激活,但对于TNF-α诱导的NF-κ B基因启动子的激活却没有影响。　　 本文的研究为病毒鉴定和检测提供了一个更为高效的的平台,并能够促进新发病毒性疾病的控制以及治疗的研究。