神经退行性疾病(Degenerative diseases of the central nervous system, ND)是一组以原发性神经元变性为基础的慢性进行性神经系统疾病。该疾病主要包括阿尔茨海默氏病、帕金森病、亨廷顿病等。研究发现,神经退行性疾病都有一个共同的特征,即发生神经元的退行性病变和凋亡。目前对神经退行性疾病的机理及治疗进行了大量的研究,但至今尚无成熟、有效的治疗方法和药物来防治这种疾病,其严重影响人类的健康和生活质量。随着干细胞研究的不断深入,为神经退行性疾病的治疗带来了曙光。干细胞是指存在于个体发育过程中,具有长期(或无限)自我更新、并能分化形成某种(或多种)特殊细胞的生物学特性的原始细胞。根据来源和分化能力,干细胞可分为:全能性干细胞、多能性干细胞、专能干细胞等。胚胎干细胞的研究已经取得了很大的进展,由于其多能性的分化潜能,人们对其寄予了很高的期望,但由于其来源的匮乏和困难,以及面临的社会伦理问题,其临床应用将面临诸多障碍。现在人们把目光瞄向了一种成体干细胞:骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)。近年来的研究表明骨髓间充质干细胞是一种增殖能力较强的、存在于骨髓非造血组织中的专能性干细胞。其一方面为造血干细胞提供物理支持,并且分泌多种生长因子和细胞因子来控制造血干细胞的成熟和分化,另一方面具有横向分化的潜能,在适当的环境下,BMSCs可以向各个胚层的细胞分化,其中包括成骨细胞和软骨、脂肪细胞、心肌细胞、肝细胞、神经元样细胞等,并且由于其具有丰富的资源、获得的便利性以及自体移植的可行性等特点,其临床应用价值很高。近年来,国内外学者通过用不同的方式,在体外完成了BMSCs向神经元样细胞的诱导分化。维甲酸可以诱导人和大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经细胞,表达早期神经元标记;而β-巯基乙醇、二甲基亚砜、4-羟基茴香醚等单独或联合使用也可以有效的诱导BMSCs向神经元转化;通过去甲基剂和生理性的神经分化因子联合诱导骨髓间充质干细胞分化成为具有电生理功能的神经元;增加细胞内cAMP水平的化合物可以促进骨髓间充质干细胞向神经细胞分化;通过基因转染技术和RNA干扰(RNAi)技术同样可以提高分化效率;而中药或其单体如:丹参和丹参酮A、黄芩苷、生黄醇提取液、麝香多肽、三七总皂苷、绞股蓝、天麻、黄连素等也可以诱导骨髓间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞。分析认为,药物诱导BMSCs分化主要和这些药物的抗氧化功能有关。黄芪作为中医药抗衰老的常用药物之一,其提取物有抗氧化、清除氧自由基等作用,因此黄芪具有诱导BMSCs进行分化的可能。基于此,我们采用原代细胞培养技术、HE染色、免疫细胞化学方法、MTT方法、流式细胞仪检测和RT-PCR技术,对黄芪早期诱导BMSCs分化的特点、黄芪对BMSCs活性的影响、诱导早期细胞内Ca2+浓度的变化、CaM mRNA的转录情况以及黄芪对BMSCs的远期诱导情况进行了初步的研究和探讨,为干细胞移植治疗神经退行性疾病,以及在此过程中的中药干预研究奠定基础。本实验分为三部分。1在无菌条件下采集大鼠股骨和胫骨骨髓进行原代培养,利用骨髓间充质干细胞贴壁生长的特点,通过传代对骨髓间充质干细胞进行纯化,通过倒置显微镜观察细胞生长情况。以第四代细胞作为实验样品,按照黄芪浓度分为40 g/L、100 g/L、200 g/L、400 g/L和对照组不加黄芪共5个组,对每个组分别诱导1小时、5小时、24小时,使用HE染色观察诱导后细胞形态学变化,免疫细胞化学技术对诱导结果进行鉴定,MTT检测黄芪对BMSCs活性的影响。结果显示:在常规培养条件下,细胞生长状态良好。通过传代,在第四代获得了高纯度的BMSCs,细胞形态多呈梭形或成纤维细胞状,胞核大而呈圆形或椭圆形。药物诱导后,细胞形态逐渐发生变化,细胞体积增大,胞核固缩,部分细胞形成细长突起,并随药物浓度增加和诱导时间延长,突起生长,部分细胞间出现网络状连接。在诱导过程中均可见到Nestin、NSE、GFAP、MAP-2等抗体的阳性表达细胞。Nestin抗体在200 g/L-24h组的阳性细胞数(126.1±10.63)明显高于其他实验组(P<0.05)。NSE抗体在400 g/L-24h组的阳性细胞数量(135.9±12.17)明显高于其他实验组(P<0.05)。GFAP抗体阳性细胞数量随药物浓度的升高和诱导时间的延长而增加,但无统计学意义(P>0.05)。在200 g/L-24h组(25.2±6.66)和400 g/L-24h组(30±6.78)中的MAP-2抗体染色阳性细胞数高于其他实验组(P<0.05)。MTT结果显示:加入药物初期,各种浓度均对细胞活性产生抑制作用,表现为浓度越高,作用越强。随着时间的延长,黄芪对细胞的营养作用显现出来,表现为随浓度的提高,细胞活性增高,其中以高浓度组最为明显,而200 g/L浓度组和400 g/L浓度组的细胞活性变化趋势基本一致。2在第一部分实验的基础上,为探讨黄芪诱导BMSCs分化的可能机制和信号传导通路,以第四代BMSCs为实验样品,使用黄芪浓度为200 g/L的诱导培养基进行分化诱导,以Fluo-3-AM作为钙离子探针,使用流式细胞仪检测在诱导10 min,30 min,60 min,120 min,300 min后BMSCs内Ca2+浓度的变化,使用RT-PCR技术检测在诱导30 min,60 min,120 min后CaM mRNA的转录情况。结果显示:细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)随诱导时间发生了变化,诱导10 min后细胞内钙离子荧光强度F10(563±1344)和诱导30 min后细胞内钙离子荧光强度F30(511±1250)明显低于诱导前细胞内钙离子荧光强度F0(677±1584) (P<0.05);诱导60 min后细胞内钙离子荧光强度F60(578±1307)有所上升,但仍低于诱导前浓度(P<0.05);诱导120 min后细胞内钙离子荧光强度F12(0845±1648)明显高于诱导前细胞内钙离子荧光强度F0 (P<0.05);诱导300 min后胞内钙离子荧光强度F300(849±1706)与诱导120 min后细胞内钙离子荧光强度F120无显著变化(P>0.05)。细胞内CaM mRNA的转录也随诱导时间发生了变化,在各组均可探测到阳性表达,并且随着诱导时间的延长,CaM mRNA的相对含量逐渐增加,并且各组之间具有显著性差异(P<0.05)。3在前两部分实验的基础上,为丰富黄芪对BMSCs诱导分化的远期作用的实验资料,拓宽黄芪及其制剂在辅助干细胞移植治疗帕金森氏症和阿尔茨海默氏病等老年性神经退化性疾病的研究中的应用,以第四代BMSCs为实验样品,使用黄芪浓度为200 g/L的诱导培养基进行分化诱导,观察药物诱导1～6天过程中,细胞的形态变化,采用免疫细胞化学方法对诱导结果进行鉴定。结果显示:细胞形态发生改变,胞体增大,自胞体伸出突起,随诱导时间的延长,细胞突起进一步伸长和出现末端分杈现象,表现为神经元样细胞的形态特征,细胞间形成网络状连接。但长时间培养后可见培养液中出现少量悬浮细胞。Nestin抗体阳性染色的细胞均可见于黄芪诱导1天、3天和6天,诱导3天阳性细胞率(61.79%)最高(P<0.05)。NSE抗体阳性染色的细胞在诱导3天后阳性细胞率(46.41%)明显高于诱导1天组(29.61%) (P<0.05),6天组(45.37%)有所下降,但无显著性差异(P>0.05)。GFAP抗体阳性染色的细胞均可见于黄芪诱导1天、3天和6天,诱导3天阳性细胞率(52.21%)明显高于诱导1天组(38.77%)(P<0.05),6天组(51.66%)有所下降,但无显著性差异(P>0.05)。MAP-2抗体阳性染色的细胞在诱导6天后阳性细胞率(45.18%)最高,与其他组有显著性差异(P<0.05)。结论1 BMSC具有易获得,易培养,生长旺盛,通过传代培养即可高度纯化的特性,在黄芪的诱导下可向神经干细胞分化。综合免疫细胞化学实验结果和MTT实验结果,认为在诱导BMSCs向神经干细胞分化进程中,200 g/L的黄芪浓度可能为较佳诱导浓度,且诱导24h组较1h组和5h组作用明显。2在黄芪诱导BMSCs分化早期,细胞内钙离子浓度出现明显下调,随诱导时间延长,细胞内钙离子浓度上升。而在此过程中,伴随细胞内钙离子浓度上调,CaM基因转录水平也同步上调。提示:黄芪在诱导BMSCs分化的过程中,钙离子-钙调蛋白介导的信号转导途径可能发挥了重要的作用。而在诱导120 min到300 min后,胞内钙离子水平维持在高位,提示诱导形成的神经元样细胞可能具有可兴奋性细胞的生理机能。3在早期,黄芪诱导BMSCs向神经干细胞分化的作用效果较好,并且诱导效率较高。而长期诱导培养则使BMSCs向神经元和神经胶质细胞分化,但其特异性分化的作用不明显。值得一提的是长期诱导培养可促进细胞突起的生长,并且促进神经元样细胞的成熟和死亡。