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无论在动物细胞中还是在植物细胞中,小G蛋白都扮演着“分子开关”的作用,原因是它们都可以通过与GTP结合而成为“活化状态”,通过水解GTP成GDP而成为“非活化状态”,这样就形成了一个循环的模式。并且这种与GTP结合和水解的循环在真核生物中是普遍存在的一种信号调控和转导的机制。鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)的作用是促进小G蛋白从GDP形式转化为GTP形式,所以也是调控小G蛋白的活性的时间空间特异性的重要参与者,再加上GEF自身在细胞中也有特定的分布特点,以及蛋白质结构上的很多接受上游作用因子的调控结构域,这使得整个小G蛋白参与的信号转导更加复杂。作为PLD的水解产物之一磷脂酸(PA)更是细胞内信号转导中的中枢枢纽,能够与不同种类的蛋白结合,协调很多信号途径,也包括ABA的很多信号途径。其中PA发挥信号转导作用的一个很重要的模式是直接与蛋白结合,因为PA分子具有独特的物化特征,可以区别于其他的脂与蛋白结合的能力,这种结合或者会改变靶分子的催化活性,或者招募靶分子到细胞膜上,或者促进形成蛋白复合体的稳定或者形成。在动物细胞中,有研究表明,PA可以与GEF蛋白Sos1结合,调控小G蛋白的活性。为了找到植物中的GEF蛋白与PA的相互作用,进行了一系列的探索实验。 本文采用分子生物学、细胞生物学和植物生理学等方法,寻找与PLDα1的产物PA结合的GEF家族的蛋白及如何对GEF活性的影响,并初步探讨了PLDα1、PA、AtRopGEF8在ABA诱导保卫细胞气孔关闭过程中的相互作用。主要结果如下: 首先提取拟南芥的各组织的RNA,反转录后,克隆到了RopGEF家族的10个基因;在大肠杆菌的表达系统中,体外表达得到重组蛋白,并且利用Fat-western和ITC的方法找到了可能与PA结合的蛋白。 为了找到AtRopGEF8与PA的结合方式,对GEF8的截断分析,结合ITC的有关数据,以及GEF8和GEF9的同源比对的结果,找到可能结合的区域是N端;对可能的结合位点点突变,利用脂结合实验结果,可以推知PA与GEF8的结合位点可能是在N端的第13位和第18位的精氨酸。 与PA结合后可以影响RopGEF8的活性的影响,通过体外和体内的活性来证明。通过Pull-down和split-YFP实验找到两个与RopGEF8结合比较强的ROP蛋白即ROP7与ROP10,进而以此为底物分析PA结合RopGEF8对其活性的影响。通过体外的活性以及体内的活性的测定,发现不同的ROP底物下,PA对GEF8的活性影响不同。以ROP7为底物时,PA与RopGEF8的结合可以提高GEF的活性,以ROP10为底物时,反而抑制了GEF的活性。 利用GEF8的GUS表达植株,发现在ABA处理下,保卫细胞中的GEF8的表达有增高的情况。进而利用GEF8的单突变体植株、回补植株以及与PLDα1的双突变体植株,比较在ABA处理下以及外施PA的条件下的气孔开度的变化,可以推测出GEF8在PLDα1的下游参与了ABA诱导的气孔关闭。 发现了与磷脂酸PA结合的蛋白RopGEF8以及可能的结合方式,初步明确了RopGEF8参与了PLDα1和PA介导ABA诱导气孔关闭的信号通路。为揭示ABA调控气孔运动的信号网路提供了新的依据。