卵巢癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一,因其在女性群体中发病率高、局部侵袭和远处转移能力强,多年来一直是妇产科研究的热点问题。肿瘤血管形成是指新生血管由瘤外长入瘤内或在瘤内扩布的过程,是肿瘤生长侵袭所必不可少的条件,对于肿瘤的发生、发展和预后起着至关重要的作用。在参与这一过程的多种因子中,血管内皮生长因子被认为是其中最关键的一类。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)亦称血管通透因子(vascular permeability factor, VPF),是一种特异地作用于血管内皮细胞的生长因子,广泛分布于人和动物体内的大脑、肾脏、肝脏、脾脏、胰腺和骨骼等器官和组织中,1989年由Ferrara等人从牛垂体滤泡星状细胞的体外培养液中首先纯化出来并命名。血管内皮生长因子(VEGF)是血小板来源生长因子家族中的一种多肽类细胞因子,是迄今发现的最强的促血管生长因子之一。其特异性作用于血管内皮细胞,通过促进内皮细胞增殖、增加血管通透性来诱导肿瘤血管生成,在肿瘤的发生及发展过程中发挥着不可替代的作用。如何通过抑制血管内皮生长因子(VEGF)来治疗恶性肿瘤已经成为肿瘤治疗研究领域的新方向。反义寡聚核苷酸(antisense oligonucleotide, ASODN)技术作为目前新兴且日益成熟的基因沉默技术,被认为是目前基因工程学领域非常有效的工具性研究技术。该技术可以特异、高效且稳定地沉默靶基因的表达,从而达到相对比较理想的沉默效果。目前,以ASODN为代表的小分子靶向干扰技术已被广泛地应用于基因功能研究、疾病病因与治疗研究等多种生命科学领域,并初见成效。本实验研究目的是：①检测VEGF在卵巢癌组织中的基因和蛋白表达,探讨VEGF与卵巢癌侵袭性的相关性以及它们之间的内在联系。②设计并构建能有效转导进入SKOV3卵巢癌细胞的针对VEGF-A基因的2-甲氧乙基修饰的ASODN;③研究该寡聚核苷酸对SKOV3卵巢癌细胞中VEGF-A基因的沉默效果,并进一步明确沉默前后SKOV3卵巢癌细胞的增殖及凋亡水平变化,评估2-甲氧乙基修饰的ASODN能否作为一种靶向VEGF-A基因的卵巢癌的基因治疗与研究的有效手段。④构建SKOV3卵巢癌细胞的裸鼠皮下种植模型,观察利用超声微泡技术介导2-甲氧乙基修饰的ASODN对裸鼠皮下卵巢癌的生长抑制效应,并对肿瘤抑制率进行测定。评估超声微泡技术介导2-甲氧乙基修饰的ASODN对卵巢癌的抑制作用。第一部分VEGF-A在卵巢癌中的表达及与生物学行为的关系目的血管内皮生长因子(VEGF)是目前已知作用最强的一种促血管生长因子,其基因在肿瘤中的表达与肿瘤的侵袭性和降低的患者生存率关系密切。本研究目的是检测VEGF在卵巢癌中的基因和蛋白的表达,并探讨VEGF-A与卵巢癌恶性程度和侵袭性的相关性以及它们之间的内在联系。方法1.标本收集2008年7月-2010年4月期间在山东省立医院妇科住院并行手术治疗的患者132例。①卵巢癌组68例,年龄29-77岁,平均年龄(55.3±6.3)岁；其中浆液性腺癌31例,子宫内膜样腺癌23例,粘液性腺癌14例；临床分期为Ⅰ、Ⅱ期为25例,Ⅲ、Ⅳ期为43例。所有患者均为第一次接受手术治疗,术前无化疗史,无其它肿瘤病史。②卵巢良性肿瘤患者组34例,年龄29-70岁,平均年龄(39.7±7.5)岁；其中浆液性囊腺瘤22例,粘液性囊腺瘤12例。③正常对照组患者30例,年龄42-70岁,平均年龄(54.1±7.1)岁；来自子宫肌瘤、功血、子宫脱垂等切除子宫同时行卵巢切除,病理证实卵巢无异常发现者。以上所有诊断均经术后病理证实。2.免疫组化染色方法采用VEGF-A鼠抗人单克隆抗体,采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接(S-P)法,按标准实验流程,检测VEGF-A基因在卵巢癌、卵巢良性肿瘤和正常卵巢组织中的蛋白表达。3.结果判定标准根据半定量免疫组织化学评价方法评价切片中VEGF-A反应阳性细胞显色强度。在高倍视野(×400)下,每张切片随机取5个视野进行观察,计算500个肿瘤细胞免疫反应阳性的细胞百分比。每张切片分别有五名实验者进行单独评价,对于有分歧的应进行重复评价,直至达到一致。4. VEGF-A表达评估强阳性(+++)：阳性细胞大于50%或显色深；中度阳性(++)：阳性细胞30%至50%之间或染色略深；弱阳性(+)：阳性细胞小于30%或显色浅；阴性(-)：无阳性细胞染色。5. FQ-PCR检测VEGF-AmRNA的表达差异取出150mg冰冻卵巢癌组织标本,按标准实验流程,抽提RNA并进行逆转录。利用FQ-PCR技术检测目的基因VEGF-A的mRNA表达情况。6. Wertem-blot检测VEGF-A蛋白水平的表达差异取200mg冰冻组织标本,按照实验过程,提取VEGF-A蛋白,利用Wertem-blot检测目的基因VEGF-A的蛋白水平的表达差异。6.统计学处理所有统计学分析均在SPSS13.0软件上进行。对免疫组化结果用卡方检验进行统计分析；对FQ-PCR半定量结果及Wertem-blot结果进行单因素方差分析,设定p<0.05有统计学意义。结果1.免疫组织化学结果VEGF-A在卵巢癌中以细胞质着色为主,仅有散在的细胞核着色。VEGF-A在卵巢癌组织中的阳性(率)为58(85.3%)；在卵巢良性肿瘤中VEGF-A的阳性(率)为12(35.3%)；而在正常卵巢组织中VEGF-A的阳性(率)仅为4(13.3%)。卡方检验示卵巢癌与卵巢良性肿瘤之间的差异有统计学意义(χ2=22.310,P=0.0001<0.05)；卵巢良性肿瘤与正常卵巢组织之间的差异有统计学意义(χ2=5.074,P=0.024<0.05)；卵巢癌与正常卵巢组织之间的差异有统计学意义(χ2=46.382,P=0.00002<0.05)。临床分期为Ⅰ、Ⅱ期的卵巢癌组织中VEGF-A的阳性率为21(84.0%),Ⅲ、Ⅳ期的卵巢癌组织中VEGF的阳性率为37(86.0%)。VEGF在Ⅰ、Ⅱ期与Ⅲ、Ⅳ期的卵巢癌组织中的表达之间的差异没有统计学意义(χ2=0.053,P=0.818)。在免疫组化反应为阳性的卵巢癌组织中以强阳性和中度阳性为主(60.3%,35/58),而在卵巢良性肿瘤中以弱阳性为主(72.7%,8/11)。2.FQ-PCR结果经方差分析,卵巢癌、卵巢良性肿瘤及正常卵巢组织之间VEGF-A的mRNA表达差异明显：卵巢癌vs卵巢良性肿瘤(P<0.05),卵巢癌vs正常卵巢组织(P<0.05),卵巢良性肿瘤vs正常卵巢组织(P<0.05),其中VEGF-A在Ⅰ、Ⅱ期与Ⅲ、Ⅳ期的卵巢癌的之间的表达无明显差异(P=0.78)。3. Wertern-blot经方差分析,卵巢癌、卵巢良性肿瘤及正常卵巢组织之间VEGF-A的蛋白水平表达差异明显：卵巢癌vs卵巢良性肿瘤(P<0.05),卵巢癌vs正常卵巢组织(P<0.05),卵巢良性肿瘤vs正常卵巢组织(P<0.05)结论1.VEGF-A在正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤和卵巢癌中均有表达。2.VEGF-A在卵巢癌、卵巢良性肿瘤和正常卵巢组织中的表达有显著性差异,因此VEGF-A与卵巢癌的恶性程度密切相关。3.VEGF-A可以作为判断卵巢癌侵袭性生长的诊断性指标和用做卵巢癌基因治疗研究的靶点。第二部分设计靶向VEGF-A基因的2-甲氧乙基修饰的反义寡聚核苷酸并测定其转染效率目的设计针对VEGF-A基因的2-甲氧乙基修饰的ASODN,并验证其转染效率,为下一步的研究做准备。方法1.设计针对VEGF-A基因的2-甲氧乙基修饰的ASODN本实验所用的A、B、C三种不同的靶向VEGF-A基因的ASODN (ASODN)均由美国Oligos Etc Inc(Oregon)设计并合成后免费馈赠。2.2-甲氧乙基修饰的ASODN转染效率的测定取培养中生长状态良好的SKOV3卵巢癌细胞,在转染前一天将细胞种在6-孔培养板进行培养,按实验设计的分组情况在转染当天加入含有针对VEGF-A基因的2-甲氧乙基修饰的不同ASODN进行细胞的转染实验。然后在转染48小时后在荧光显微镜下观察红色荧光蛋白RFP的表达情况,观测载体的转染效率。结果在3组针对VEGF-A基因的2-甲氧乙基修饰的ASODN中,1#、2#、3#转染效率分别86.5±4.5%、91.2±5.7%、92.1±2.8%结论1.本部分实验说明,针对VEGF-A的2-甲氧乙基修饰的ASODN可以有效的转染目的细胞.2.通过该部分实验,为下一步用反义寡居核苷酸对卵巢癌细胞SKOV3进行实验提供了可靠的基础。第三部分利用2-甲氧乙基修饰的反义寡聚核苷酸沉默VEGF-A基因并检测该抑制作用对卵巢癌细胞SKOV3增殖及凋亡水平的影响目的利用构建好的针对VEGF-A基因的2-甲氧乙基修饰的ASODN,研究不同RNA ASODN对卵巢癌SKOV3细胞VEGF-A基因的抑制情况以及对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响及其意义。方法1.实验分组1)：空白对照组：SKOV3 cells (no ASODNs and no lipofectin),2)：阴性对照组：SKOV3/Silence (-) cells(no ASODNs),3)：实验组1#：SKOV3/Silencel (+) cells,4)：实验组2#：SKOV3/Silence2 (+) cells,5)：实验组3#：SKOV3/Silence3 (+) cells,其中,实验组1#、2#、3#为分别转染1#、2#、3#ASODN的卵巢癌细胞组,阴性对照组不含ASODN,空白对照组不含ASODN及脂质体,其余处理同对照组。2.按实验分组,分别用含有针对VEGF-A基因的新型ASODN1#、2#、3#转染卵巢癌细胞株SKOV3细胞。首先培养生长状态良好的SKOV3细胞；在转染前一天将SKOV3细胞种入6-孔培养板进行培养,转染当天,按实验设计的组别分别将含有反义寡聚合甘酸1#、2#、3#转入卵巢癌细胞,阴性对照组不含ASODN,空白对照组不含ASODN及脂质体,其余处理同对照组。3.测定VEGF基因的沉默效果用FQ-PCR技术检测目的基因VEGF-A的mRNA表达情况,同时通过Western-blot方法检测VEGF-A蛋白表达,测定VEGF-A基因的沉默效果。4.MTT检测细胞增殖水平转染前一天,将生长状态良好的细胞种入96-孔培养板培养。第二天按实验分组分别进行转染,转染24小时后,进行MTT分析,检测不同ASODN对卵巢癌细胞株SKOV3细胞增殖水平的影响。5流式细胞计数检测SKOV3细胞的凋亡情况将生长状态良好稳定转染反义寡聚合甘酸的SKOV3细胞按实验设计的要求(空白对照组、实验组1#、实验组2#、实验组3#)进行流式细胞分析,检测经过实验处理的SKOV3细胞的细胞周期及凋亡情况。结果1.FQ-PCR结果显示,和对照组相比,反义寡居核苷酸1#、2#、3#对卵巢癌SKOV3细胞中VEGF-A基因的表达有显著沉默作用,它们的沉默效率分别为68.4%、69.4%、55.7%,Western-blot结果显示了类似的沉默效果。2.MTT检测细胞增殖水平实验结果表明,实验组1#,2#,3#的增殖抑制率(PIR)分别为42.5%、38.7%和44.5%,与阴性对照组和空白对照组相比差异有显著性(P<0.05),这一结果提示在VEGF-A基因被沉默后,卵巢癌细胞的增殖能力明显减弱,肿瘤细胞的生长能力明显被抑制。3.流式细胞计数检测SKOV3细胞的凋亡结果说明,通过流式细胞计数分析不同处理的细胞群体中各时期细胞的比例,结果发现三个转染反义寡聚合甘酸SKOV3细胞的实验组与对照组比较,其沉默VEGF-A后,SKOV3细胞群中凋亡细胞显著增加(P<0.05)。结论1.2-甲氧乙基修饰的ASODN对SKOV3卵巢癌细胞株的生长和增殖能力具有明显的抑制作用；利用针对VEGF-A基因的ASODN特异性沉默VEGF-A基因能引起卵巢癌细胞生长周期迟缓、诱发卵巢癌细胞凋亡,VEGF-A基因能够作为卵巢癌瘤基因治疗的有效靶点。2.针对VEGF-A基因的ASODN能够特异性沉默VEGF-A基因,在卵巢癌基因靶向治疗方面具有非常重要的研究及应用价值。第四部分’超声微泡介导的靶向VEGF-A基因的2-甲氧乙基修饰的反义寡聚核苷酸抑制裸鼠卵巢癌生长的实验研究目的在体内验证靶向VEGF-A基因的2-甲氧乙基修饰的反义寡聚核苷酸对卵巢癌生长的抑制作用,并探讨超声微泡介导基因转染作用的有效性。方法30只Balb/c裸鼠皮下接种人卵巢癌细胞SKOV3后,待所有皮下种植瘤瘤体体积均超过300mm3后,随机将30只成瘤裸鼠分为3组,每组10只。分别为①超声+脂质体微泡+靶向VEGF的2-甲氧乙基修饰的反义寡聚核苷酸组,即UM+ASODN组。该组中10只裸鼠每只均给予400μL脂质体/optison(?)微泡混合液／3#寡聚核苷酸(含2.5ug反义寡聚核苷酸)瘤中心注射。②超声+脂质体微泡组即UM组,该组中10只裸鼠每给予100μLD-Hanks液+300μLoptison(?)微泡皮下种植瘤瘤中心注射③空白对照组即BC组,该组中10只裸鼠,每只裸鼠均给予400μL D-Hanks液瘤中心注射。所有30只裸鼠接受各自相应处理后,立即在瘤体表面皮肤涂以超声耦合剂,并给予1 MHz超声辐射,强度为1.0W/cm2,每次30s,间隔30s,共2次60s照射。伺候每3天用游标卡尺测量皮下肿瘤长径(a)及短径(b)变化,肿瘤体积根据公式V=πab2/6计算。15天后采用颈椎脱位法处死小鼠,称取瘤重。统计学分析采用统计学软件SPSS16.0英文版进行,方差齐时多组均数比较采用方差分析,两两比较采用LSD检验；方差不齐时多组均数比较采用方差分析,两两比较采用DUNNETT’s T3检验。设定p<0.01具有极显著性差异,p<0.05具有显著性差异。结果1.肿瘤的体积、瘤重与抑瘤率(1) UM+ASODN组、UM组与BC组观察至超声照射后15天,裸鼠皮下种植瘤体积分别为108.2±26.42mm3,297.8±44.22mm3,339.7±41.32mm3。各组种植瘤体积不同(F=104.67,p=0.00<0.01)。LSD法两两比较UM+ASODN组与其他两组均有极明显差异(p=0.00<0.01)。表明UM+ASODN组裸鼠皮下种植瘤体积较其他两组较小且差异极为明显。UM组与BC组相比有明显差异(p=0.021<0.05),表明与BC组相比,UM组裸鼠皮下种植瘤体积明显较小。(2) UM+ASODN组、UM组与BC组观察至超声照射后15天,裸鼠皮下种植瘤体积分别为0.70±0.08g,1.45±0.14g,1.66±0.23g。各组瘤重不同(F=93,87,p=0.00<0.01). DUNNETT’s T3法两两比较UM+ASODN组瘤重较其他两组有极明显差异(p=0.00<0.01), UM+ASODN组裸鼠皮下种植瘤瘤重较其他两组较小且差异极为明显;UM组与BC组差异不具有统计学意义(p=0.078)0.05)。(3)超声辐射15天后处死裸鼠时,可见UM+ASODN组裸鼠皮下种植瘤肿瘤体积较小,颜色苍白,与周围组织边界较为清楚,局部存在类似包膜组织包裹；而UM组与BC组裸鼠皮下种植瘤瘤体较大,色红,血管组织丰富,呈浸润性生长,与周围组织边界不清。结论1.本实验成功构建了SK0V3人卵巢癌皮下种植的裸鼠模型。2.实验中成功利用超声联合optison(?)造影剂微泡介导VEGF-A基因的2-甲氧乙基修饰的反义寡聚核苷酸转染处理了SKOV3人卵巢癌裸鼠皮下种植的裸鼠模型3.实验结果验证了体内环境下超声联合微泡造影剂optison(?)介导靶向VEGF-A的的2-甲氧乙基修饰的反义寡聚核苷酸转染卵巢癌SKOV3细胞极大的抑制了肿瘤的生长