VDAC(电压依赖性阴离子通道)是最早发现于线粒体外膜的一种含量丰富的蛋白质,对VDAC的进一步研究表明VDAC不仅存在于线粒体内外膜,而且存在于人类淋巴细胞及上皮细胞的质膜,甚至是红细胞膜上和人精子膜上。在酵母体内只含有一种VDAC1基因,在人类和小鼠含有3种VDAC基因,即VDAC1,VDAC2和VDAC3,同源性75％～94％,其编码的蛋白质具有通道样结构特点。 研究表明,VDAC是一种孔道蛋白,具有电压依赖性。线粒体上的VDAC在孔道开放时,能够跨膜转运各种代谢物如阴离子(C1-、ATP、ADP、磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐和超氧化物等),阳离子(Ca2+、Mg2+、K+和Na+等),实现细胞凋亡等过程。质膜上的VDAC不参与阴离子的转运及ATP的释放,质膜上的VDAC1能充当NADH-铁氰化物还原酶的作用,而VDAC2具有转运柠檬酸盐及二价阳离子的作用,可作为一种NADH依赖的还原酶.柠檬酸铁的受体,或者作为Fe2+和柠檬酸盐的运载体。VDAC2也调节一些控制氧化还原态的酶的活性,如含有超氧化物歧化酶的铜和锌。 VDAC目前的研究热点主要是研究其在能量代谢及在细胞凋亡中的作用。VDAC上具有甘油和己糖激酶的结合位点,在代谢活化过程中,细胞质内的这些酶优先使用ATP和偶联氧化磷酸化。大量事实证明VDAC参与介导了促凋亡蛋白的释放,并且Bcl-2家族蛋白可直接作用于VDAC调控凋亡,如Bax/Bak/Bim可促使VDAC孔道开放,导致内外膜之间存在的蛋白释放,而Bcl-2/Bcl XL可抑制这-过程。氧自由基可直接打开VDAC1孔道而允许细胞色素C释放,并且氧自由基打开VDAC孔道与Bax/Bak无关。高浓度Ga2+可打开PTP孔道,低浓度Ga2+可促使其他因子对PTP的开放作用,这种作用已被确定也有VDAC的参与。孔道开放,细胞凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)和细胞色素C(Cytc)从线粒体内释放进入细胞质,在细胞质中Cytc首先与凋亡蛋白酶激活因子21(apoptosis protease activating factor21,Apaf21)及pro-caspase29(caspases家族成员,激活caspaSes的起始因子)结合,形成激活的Apaf21和caspase29。此后,激活的Apaf21和caspaSe29作用于具有蛋白水解活性的caspases(cysteine aspartase,统称为胱冬肽酶),caspases被激活后则能水解细胞蛋白而导致细胞凋亡。此外,胞浆中的代谢相关的己糖激酶Ⅱ能转移至线粒体,与VDAC相互作用,并抑制Bax与VDAC的相互作用,从而调节细胞凋亡。现在对VDAC功能的研究都是把提纯的VDAC重组到人工的脂质膜上进行,限制了对其的进一步研究。要深入了解VDAC蛋白的功能必须解析它的三维结构,但对蛋白质三维结构的解析和功能研究常需要毫克数量级的高纯度蛋白,而内在膜蛋白含量很低,难以纯化到培养晶体所需要的量。本课题尝试建立VDAC2蛋白的原核表达载体,体外诱导其大量表达。 方法: 1.pMBP-P-VDAC2和pTrc-CKS-VDAC2重组质粒的构建 Trizol法从培养的人肝癌细胞中提取总RNA,经RT-PCR扩增出VDAC2基因。回收纯化后的VDAC2基因与pGEM-T-easy载体连接后转化TOP1OF进行蓝白斑筛选、小量扩增抽提质粒酶切鉴定。凝胶回收双酶切后的VDAC2与经同样酶双酶切的表达载体质粒pMBP-P、pTrc-CKS在T4 DNA连接酶的作用下进行连接。连接产物经抗生素筛选,质粒酶切鉴定后测序。 2.VDAC2融合蛋白的表达及表达条件的优化 将鉴定正确的重组质粒pMBP-P-VDAC2和pTrc-CKS-VDAC2转入表达宿主菌DH5α,BL21(DE3)LySs中,经IPTG诱导表达。在不同温度及不同诱导剂浓度下分析其蛋白表达的情况。温度分别设为37℃、30℃、25℃、20℃和16℃。IPTG诱导剂的浓度为0mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM和0.8mM。 结果: 1.细胞中提取的RNA电泳后出现28S、18S、5S三条橘黄色条带,28S：18S的亮度比约为2:1,经RT-PCR扩增出902bp的条带。大小与预计相符。 2.pMBP-P和pTrc-CKS质粒与VDAC2基因经NheI、EcoRI双酶切后进行连接,经测序证实,结果与数据库中人VDAC2的序列完全符合,并证明VDAC2基因已克隆至表达载体上,成功构建了重组表达质粒pMBP-P-VDAC2和pTrc-CKS-VDAC2。 3.不同的表达宿主菌DH5 α、BL21(DE3)LySs中两种融合蛋白均有表达,在BL21(DE3)LySs菌中的表达量相对高些。在不同温度下诱导重组质粒转化进表达宿主菌中进行表达,表达产物主要以包涵体形式出现,蛋白表达量随时间的增长有所增加。不同IPTG浓度诱导,结果发现表达的蛋白量没有明显区别。 结论: 1.从培养的人细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增出VDAC2基因,并将其克隆入原核表达质粒pMBP-P和pTrc-CKS,构建了pMBP-P-VDAC2和pTrc-CKS-VDAC2融合蛋白重组质粒。 2.体外诱导重组质粒表达目的蛋白,通过优化得到最佳诱导条件并对其表达蛋白做定位分析。用带有分子伴侣的载体来尝试表达人VDAC2,虽表达的蛋白主要以包涵体形式为主,但可超量表达。