免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia,ITP)是一种免疫介导的血小板减少性疾病,约占临床出血性疾病的30%,以外周血血小板减少(<100×109/L)、易出血和出血倾向为主要临床表现。原发性ITP的发病机制复杂,主要为机体免疫耐受失衡,免疫系统对自身血小板和巨核细胞破坏增加,导致骨髓巨核细胞发育成熟障碍和血小板生成减少以及外周血小板破坏增多。其中,自身免疫性B细胞及其产生的血小板特异性自身抗体在ITP血小板病理性破坏过程中起到重要作用。自身抗体与血小板表面的糖蛋白结合,通过结和巨噬细胞表面的Fcy受体使血小板在网状内皮系统的破坏增加。此外,T细胞凋亡异常、T细胞亚群比例失调以及细胞毒性T细胞直接介导的血小板溶解等也在ITP发病中起到重要作用。随着人们对于B细胞活化因子(B cell activating factor,BAFF,亦称作BLyS, TALL-1,THANK,zTNF4,TNFSF13B)及其受体(BAFF-R,TACI和BCMA)在淋巴细胞的产生(尤其是B细胞)、免疫耐受的建立以及免疫反应调控中作用的认识不断深入,BAFF/BAFF受体系统在自身免疫性疾病发病中的作用日渐受到重视。既往研究发现,BAFF过度表达是类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)、干燥综合征以及系统性硬化等多种自身免疫性疾病发病的重要环节。迄今为止,非特异性免疫抑制疗法依然是治疗ITP的一线方案。近十余年来利妥昔单抗(rituximab)清除B细胞被广泛接受作为ITP的二线治疗方案,且越来越受到人们的重视。尽管其与之前的治疗方案相比缓解维持时间明显延长,但该治疗措施仍存在感染率高、起效过缓等不足之处。2011年,一种能中和BAFF的生物制齐—belimumab—-作为治疗SLE的新选择,成为第一种临床试验证实有效的SLE靶向治疗药物,这开启了自身免疫性疾病特异性免疫调节治疗的新纪元。本研究旨在探讨BAFF及其受体在慢性ITP患者不同免疫器官(或组织)的表达情况和功能异常,从细胞和分子水平探讨BAFF/BAFF受体系统在ITP发病中的作用,从而完善我们对于ITP发病机制的认识,并为ITP特异性免疫调节性治疗提供可能的新思路。第一部分慢性ITP患者BAFF体系的异常表达及其意义研究背景BAFF作为一种重要的B细胞存活因子,不仅广泛参与调节B细胞发育、分化及抗体的产生,而且还在T细胞的活化和免疫应答过程中的类型转化及细胞因子的分泌起调节作用。既往许多研究已经证实,以系统性红斑狼疮为代表的多种自身免疫性疾病患者外周血中可溶性BAFF(soluble BAFF,sBAFF)的水平较健康人群明显升高,说明BAFF的过量表达是自身免疫性疾病发病的重要危险因素。BAFF的免疫调节作用是通过细胞表面的三种受体介导完成的,他们分别是BAFF-特异受体(B-cell activation factor receptor,BAFF-R,亦称BR3,TNFRSF 13C),转膜激活剂、钙调节剂和亲环素配体相互作用物(transmembrane activator and calcium-modulating cyclophilin ligand interactor, TACI，亦称TNFRSF13B)和B细胞成熟抗原(B-cell maturation antigen,BCMA,亦称TNFRSF17)。BAFF-R 是 BAFF的特异性受体,而TACI和BCMA也是另一种细胞因子—增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand,APRIL)的受体。虽然已有实验室和临床数据显示慢性ITP患者外周血sBAFF水平明显升高且其升高程度与病情严重程度密切相关。但是,目前对于BAFF体系在ITP患者体内免疫失耐受过程中的作用尚不清楚,而BAFF受体介导BAFF调节作用的具体机制仍待明确。目的检测慢性ITP患者及缺铁性贫血(iron deficiency anemia,IDA)患者骨髓上清sBAFF及其受体在不同分化阶段的B淋巴系细胞表面表达情况；研究BAFF受体在脾脏内的分布情况并对比ITP脾切除患者和外伤致脾破裂(traumatic spleen rupture,TSR)患者脾脏内三种受体的表达差异,比较两种患病人群脾脏不同发育阶段B细胞表面三种BAFF受体的表达情况；分析外周血BAFF/BAFF受体系统在慢性ITP患者及健康对照不同淋巴细胞亚群中的表达差异。通过对比不同人群各淋巴器官BAFF体系的表达情况,总结慢性ITP患者体内BAFF体系的表达特征,从而明确ITP患者体内BAFF/BAFF受体系统在淋巴细胞发育(免疫失耐受的建立)及血小板相关自身免疫应答过程中的作用。方法抽取36例慢性ITP患者及27例IDA患者骨髓,26例慢性ITP患者及22例健康对照外周血,分离血浆和单个核细胞。收集13例ITP脾切除患者及8例外伤致脾破裂行脾切手术患者的脾脏组织及脾脏单个核细胞。酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunoadsorbent assay,ELISA)检测骨髓上清和外周血浆中BAFF和APRIL的浓度；实时定量反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)检测BAFF及BAFF受体mRNA的相对表达水平。改良单克隆抗体特异性俘获血小板抗原(monoclonal antibody immobilization of platelet antigens,MAIPA)技术检测骨髓IgG、IgM型抗GPⅡb/Ⅲa和GP I b/XI自身抗体水平。流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测骨髓、脾脏和外周血不同分化及发育阶段B淋巴系细胞表面三种BAFF受体的表达情况。免疫组织化学染色法(immunohistochemistry,IHC)和免疫荧光(immunofluorescence,IF)技术检测脾脏BAFF受体的分布和表达情况。结果1 慢性ITP患者骨髓、脾脏以及外周单个核细胞BAFF表达明显增高1.1 在mRNA水平,慢性ITP患者骨髓、脾脏及外周血单个核细胞BAFF表达水平显著高于其各自对照组。1.2慢性ITP患者骨髓上清sBAFF 和 APR IL水平较对照组明显升高。慢性活ITP患者外周血血浆sBAFF水平较健康对照显著增升高。1.3慢性ITP患者骨髓上清sBAFF浓度与CD10-B细胞表面BCMA阳性率呈正相关；APRIL浓度与患者骨髓上清IgM型抗GPⅡb/Ⅲa自身抗体浓度呈正相关。2 三种BAFF受体在骨髓各发育阶段B系淋巴细胞表面的异常表达。根据B淋巴系细胞在骨髓中的各个分化阶段,将骨髓B淋巴系细胞分成B前细胞(包括祖B细胞和前B细胞)、B细胞以及浆细胞三个阶段。流式结果统计发现,2.1 慢性ITP患者B前细胞表面BAFF-R阳性率显著低于IDA患者。2.2慢性ITP患者成熟B细胞表面BCMA的阳性表达率以及浆细胞表面TACI阳性率均明显高于对照组3 BAFF受体在ITP患者脾脏内的异常表达3.1 通过IHC染色,我们发现首先明确了三种BAFF受体在脾脏的分布特征。BAFF-R在白髓区广泛表达,但存在两种不同的表达形式：动脉周围淋巴鞘区(periaterial lymphatic sheath,PALS)和滤泡区(follicular zone,FO)仅有少数散在分布的BAFF-R阳性细胞,但B AFF-R着色较强；边缘区(marginal zone,MZ)有相对PALS较弱但广泛分布的BAFF-R染色；TACI阳性细胞散在分布在PALS及红髓区；BCMA在红髓和白髓均有少量散在细胞表达,无固定的分布模式。3.2 通过对IHC染色的统计学分析,我们发现ITP患者脾脏FO以及MZ区BAFF-R的表达强度明显高于TSR患者。3.3 IF染色进一步明确了ITP患者淋巴滤泡周围区中BAFF-R表达异常增高的细胞同时高表达IgM。3.4通过流式细胞术对细化不同发育阶段的B细胞分别进行分析,我们发现ITP患者MZ区B细胞表面BAFF-R的平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)明显高于对照组。而FO区和PALS区B细胞表面三种受体表达无显著差异。此外,慢性ITP患者脾脏CD4+记忆T细胞和CD8+记忆T细胞表面MFIBAFF-R及MFITACI均较对照组相应的淋巴下表亚群明显增高。4 慢性ITP患者BAFF受体在外周血淋巴细胞亚群的异常表达4.1 通过免疫磁珠分选技术分别阳性选取慢性ITP患者以及健康对照外周CD19+、CD4+以及CD8+淋巴细胞并进行RT-PCR分析。结果显示两组研究对象各淋巴细胞亚群三种BAFF受体的表达在mRNA水平不存在统计学差异。4.2 通过流式细胞术,我们发现慢性ITP患者表面BAFF-R阳性率较健康对照显著降低。与之相反的是,病号组B细胞MFITACI显著高于健康对照组。同时,B细胞表面BAFF-R阳性率与外周血浆sBAFF浓度呈线性负相关。结论1 在慢性ITP患者的骨髓中,BAFF和APRIL均参与了血小板相关自身免疫反应,然而介导两种细胞因子作用的受体有所不同,前者主要通过BCMA发挥作用,而后者通过TACI提高了浆细胞对自身抗血小板抗体的分泌。2 ITP患者脾脏过度表达的BAFF与自身反应性B细胞表面相应的受体结合而协其免疫逃逸,是ITP患者B细胞免疫耐受失衡的重要机制之一。此外,ITP患者边缘区B细胞BAFF-R表达显著上调,能通过与该区非自身免疫性B淋巴细胞竞争性结合BAFF而抑制自身的凋亡,这是ITP患者B淋巴细胞免疫耐受失衡的另一可能机制。3 ITP患者外周血各淋巴细胞亚群表面BAFF-R表达显著低于健康人群,可能与外周血血浆sBAFF水平明显增高有关。意义通过系统性分析BAFF及其受体在B淋巴细胞发生、发育以及免疫应答等不同阶段的各淋巴组织和器官内表达情况,揭示了BAFF体系的表达异常导致ITP患者体内B系淋巴细胞在生成、发育及免疫应答过程中的免疫耐受失衡的可能作用机制。第二部分BAFF/BAFF受体系统在ITP血小板特异性免疫反应中的调节作用研究背景及目的既往实验证实,BAFF既能促进B细胞的抗体分泌,也为T淋巴细胞在免疫反应中的活化提供重要的共刺激信号。通过第一部分的研究,我们发现BAFF及其受体在ITP患者不同淋巴器官和组织中的表达存在显著异常。此外,我们还发现不同发育阶段以及不同亚群的淋巴细胞表面BAFF受体表达的情况各有差异。其中,脾脏作为ITP患者自身反应性淋巴细胞初始免疫应答以及血小板免疫性破坏的主要部位,BAFF及其特异性受体BAFF-R的表达均显著高于对照组人群。因此,为了进一步探讨三种BAFF受体在血小板免疫过程中扮演的各自角色,我们建立了一个血小板反应性的体外培养体系,同时利用特异性抗体对淋巴细胞表面的三种BAFF受体分别进行功能性阻断,从而进一步研究BAFF及其受体在ITP血小板特异性免疫反应中的作用。方法分别采集33名慢性ITP患者及28名健康对照外周血CD14-单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMNCs)并其分为BAFF组、BAFF-R组、TACI组、BCMA组及对照组。各组分别加入不同BAFF受体阻断抗体,从而对外周淋巴细胞表面的BAFF受体进行功能性阻断。负荷血小板抗原的成熟树突状细胞(dendritic cells,DCs)的诱导：免疫磁珠分选CD14+单核细胞,用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte-macrophage stimulating factor, rhGM-FSF;1000 U/mL).重组人白细胞介素-4(recombinant human inteleukin-4, rhIL-4;1000 U/mL)以及自身过期血小板(1×106/mL)培养5天,培养后的未成熟DC培养体系加入重组人肿瘤坏死因子-α(recombinant human tumor necrosis factor-a, rhTNF-a; 500 U/mL)培养2天以诱导成熟建立血小板特异性混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR)体系：负荷血小板抗原的成熟DCs与BAFF受体功能性阻断后的淋巴细胞混合培养(DCs:PBMNCs:1:10)。流式细胞术(flow cytometry)检测血小板特异性MLR体系中各淋巴细胞亚群的凋亡、增殖、活化以及转化的情况；流式细胞术和实时定量聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)检测培养后淋巴细胞各凋亡相关基因的表达情况。体外培养血小板膜糖蛋白(glycoprotein,GP) Ⅱb/Ⅲa反应性淋巴细胞的扩增：在重组人白细胞介素(recombinant human interleukin-2,rhIL-2; 50U/mL)的刺激下,外周单个核细胞与血小板Ⅱb/Ⅲa(10μg/mL)抗原共培养5天。酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunoadsorbent assay,ELIS A)检测培养上清中BAFF、APRIL、干扰素-γ (interferon-γ, IFN-γ)、白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、IL-4、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)及肿瘤坏死因子-β1(tumor necrosis factor-p,TNF-β1)浓度。选取另外23名GPⅡb/Ⅲa自身抗体阳性的慢性ITP患者以及20名健康对照,流式检测其活化和未活化的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa反应性淋巴细胞表面三种BAFF受体的表达情况。结果1 BAFF/BAFF-R信号通路对免疫效应细胞的作用1.1 无论是慢性ITP患者还是健康人BAFF组和BAFF-R组CD19+B细胞凋亡较对照组明显降低。慢性ITP患者BAFF组和BAFF-R组B细胞增殖较对照组显著增强。1.2慢性ITP患者BAFF组和BAFF-R组CD8+T细胞凋亡较对照组明显降低。1.3慢性ITP患者BAFF及BAFF-R组B细胞和CD8+T细胞胞内Bcl-2、 Bcl-XL(仅B细胞)表达明显高于对照组。1.4慢性ITP患者BAFF组和BAFF-R组CD19+B田胞表面CD25和CD86表达较对照组明显上调；而CD80阳性率在同一人群的五组细胞间无统计学差异。2 BAFF/TACI信号通路对T细胞功能的作用2.1 慢性ITP患者BAFF组和TACI组CD4+T细胞及CD8+T细胞增殖较基线组明显增强2.2慢性ITP患者TACI组CD4+和CD8+效应型记忆T细胞比例明显高于对照组。2.3慢性ITP患者BAFF组INF-y浓度及TACI组培养上清IL-4、IL-6浓度较对照组明显升高。3 活化的自身反应性淋巴细胞表面BAFF受体显著上调3.1 在慢性ITP患者及健康对照体内,活化的血小板反应性淋巴细胞表面BAFF-R及TACI表达较相应的未活化细胞均显著增高。3.2 慢性ITP患者活化的自身反应性淋巴细胞表面BAFF-R及TACI表达均显著高于健康患者体内相应的淋巴细胞亚群。结论1 B细胞和CD8+T细胞是主动免疫应答过程中主要的免疫效应细胞。BAFF/BAFF-R信号通路通过上调Bcl-2和Bcl-xL等抗凋亡基因的表达,抑制了B细胞和CD8+T细胞的凋亡。同时,B细胞的增殖在该信号通路作用下明显增强。2 BAFF/TACI信号通路主要对CD4+和CD8+两种T细胞亚群的生物学行起作用。TACI与BAFF结合后不仅增强了CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖,还促进了两种细胞亚群终末效应型T细胞的转化以及IL-4和IL-6的分泌。3 BAFF不受体间功能可能存在之间或间接的拮抗或协同作用。3.1 BAFF能有效促进1型辅助性T细胞(T-helper typel, Thl)反应相关细胞因子IFN-γ的分泌,而这种活化作用是在多各受体的协同作用下完成的,任何一种受体单独作用均不能有效传递该促进作用。3.2 TACI能促进2型辅助性T细胞(T-help type2,Th2)反应相关细胞因子IL-4、IL-6的分泌。但三种BAFF抗体共同作用时这种效应被抑制。4 慢性ITP患者淋巴细胞的BAFF反应性显著增高4.1在ITP患者,BAFF-R不仅介导BAFF对B细胞凋亡的抑制作用,还促进B细胞及CD8+T细胞的增殖。TACI促进ITP患者CD4+及CD8+T淋巴细胞的增殖、转化以及IL-4、IL-6的分泌。而对于健康患者,BAFF仅通过BAFF-R的介导显著降低B细胞的凋亡；对B细胞增殖以及T细胞的功能无显著作用。这说明慢性ITP患者淋巴细胞对BAFF的反应性显著高于健康人群。4.2 通过进一步研究,我们发现ITP患者活化的GPIIb/IIIa反应性淋巴细胞表面BAFF-R或TACI表达较健康对照体内自身反应性细胞显著上调可能是导致ITP患者淋巴细胞BAFF反应性增高的原因。意义我们的体外功能是要明确了各种BAFF受体在ITP血小板相关免疫反应中对淋巴细胞生理活性的各个方面产生不同的影响,因此特异性地阻断某一种BAFF受体的功能可以定向调节免疫反应向预期方向进行。因此,我们的实验为ITP的特异性免疫调节治疗提供进一步理论依据。