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本论文重点分别采用LC-MS、GC-MS、1HNMR代谢组学技术、iTRAQ蛋白组学技术及宏基因组学技术分析日粮碳水化物平衡及热应激对奶牛机体代谢的影响机制,寻找可以反映不同碳水化合物日粮模式及热应激条件下奶牛热代谢途径的变化的生物学标记物,并揭示其生理机制。1.试验选用8头荷斯坦头胎奶牛作为试验动物,4头奶牛安装永久瘤胃瘘管,试验采用4×4拉丁方设计。每期试验21d,适应期14d,采样期7d。采用日粮中性洗涤纤维与淀粉比例(NDF:starch)表示日粮碳水化合物组成,通过改变日粮中燕麦草、玉米青贮以及玉米的比例设计4种不同碳水化合物组成日粮:日粮1(NDF:starch=0.86)、日粮2 (NDF:starch=1.18)、日粮3 (NDF:starch=1.63)和日粮4 (NDF:starch=2.34)。试验动物每天于06:30和16:30饲喂2次。在每个试验期的最后三天,分别采集每头奶牛的血浆、尿液、牛奶、瘤胃液和粪便。采用HPLCQ-TOF MS分析代谢物,通过保留时间和质谱确定鉴定的代谢物;采用16 rRNA高通量测序分析瘤胃液菌群多样性。结果显示:(1)四种NDF:Starch日粮模式下,粪便中发现31种差异代谢物,瘤胃液中5种,血浆中3种,尿中6种。其中瘤胃液中白三烯含量增加(P<0.05);血浆脂肪酸增加(P<0.05)、维生素D3增加(P<0.05);尿中葡萄糖醛酸苷含量下降(P<0.05),尿中异戊酸酯含量先下降后升高(P<0.05)、L-异亮氨酰-L-脯氨酸增加(P<0.05)。本试验中所有差异代谢物与几种代谢途径相关,包括脂肪酸生物合成,维生素D3、氨基酸、蛋白质和生物碱的代谢,胆汁分泌和炎症介质调节。综合来看,不同的NDF:淀粉比例可影响乳牛瘤胃内外的代谢,其中一些代谢反应可归因于NDF:淀粉比对动物生产力和健康的影响。(2)当日粮NDF与淀粉比从0.86增加到2.34,瘤胃液中的门厚壁菌门的相对丰度线性增加,而拟杆菌门,无壁菌类,黏胶球形菌,candidate_division_SR1线性下降(P<0.05)。细菌属分类中检测到,随着NDF与淀粉比例增加,瘤胃球菌属,粪球菌属,互营球菌属的相对丰度线性增加,而厌氧原体属和RC9_gut_group的相对丰度降低。随着NDF与淀粉比例的增加,由Chao1和ACE测定的瘤胃细菌的丰度线性降低(P< 0.05)。β多样性分析结果表明,对应于NDF:淀粉比0.86和1.18与1.63和2.34,瘤胃细菌菌群分成两个不同的组(P< 0.05)。综上所述,增加NDF与淀粉比降低细菌多样性,但使纤维分解菌增加。2.选取四头泌乳日龄(101±10天)、体重(574±36 kg)、产奶量(38±2.4 kg/d)相近的经产健康荷斯坦奶牛,随机分配到四个大家畜环境控制舱。试验动物随机分两组,采取2X2交叉试验设计,试验共两期,每期18d (其中预试期和试验期各9天),两期之间间隔30天。预试期四头牛均处于热中性环境(温度:20 ℃;相对湿度:55%; THI: 65.5; 12h光照),且自由采食。试验期分热应激组(HS,n=2;温度:6: 00～18: 00,36 ℃,18: 00～6:00,32 ℃;相对湿度:55%; THI: 84.5; 12 h光照)和非热应激配对限饲组(PFTN,n=2;温度:20 ℃;相对湿度:55%; THI: 65.5; 12 h 光照),其中热应激组为自由采食,且提供足够量的TMR饲粮。非热应激配对限饲组每日饲喂量(采食量)占该组牛预试期平均采食量百分比与热应激组前一日采食量占该组牛预试期平均采食量百分比(比例变化范围:26.8%～61.0%)保持一致。在每期的第9天05:00 (采食前)10: 00点(采食后)收集瘤胃液;于每期试验结束前一天利用乳腺采样器和肝脏采样器进行乳腺组织和肝脏组织活体采样。采用LC-MS、GC-MS和1HNMR的代谢组学技术研究分析了热应激条件下奶牛瘤胃液代谢物变化情况;用iTRAQ蛋白质组学方法,研究热应激奶牛与非热应激限饲组奶牛乳腺和肝脏中蛋白质丰度的变化。结果显示,(1)热应激奶牛与限饲配对奶牛瘤胃液中的代谢差异物可以很好的进行区分。LC-MS,GC-MS和1H NMR结果显示,热应激奶牛瘤胃液中葡萄糖、半乳糖、甘油、丁酸盐、葡糖胺、二十七烷和三七烷的含量增加,而脂肪酸和氨基酸减少。热应激奶牛瘤胃液中代谢差异物与几种代谢途径相关,包括尿循环途径、氨基酸代谢、色氨酸代谢和柠檬酸循环,这可能影响乳成分合成的前体供应。(2)乳腺组织中差异表达蛋白质与丙酮酸、乙醛酸和二羟酸代谢途径有关,而肝脏中的差异表达蛋白质参与氧化磷酸化和抗原加工和表达途径。几种热休克蛋白直接相互作用,被认为是蛋白质相互作用网络中的“中枢”。研究结果显示,热应激条件下肝脏和乳腺组织中蛋白质生物合成途径的改变可能导致热应激奶牛乳成分变化的一个原因。