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目的通过动物和分子生物学实验了解溴丙烷的两种同分异构体对雄性大鼠生殖系统的影响,以及两种同分异构体的毒性作用和机理有何不同;初步探讨表观遗传调控在溴丙烷生殖毒性中的作用。为最终阐明溴丙烷对人类的生殖毒性和毒性的表观遗传机理并制定溴丙烷的职业卫生标准提供理论依据。方法1. 18只SPF级SD大鼠随机分为三组:对照组,1-溴丙烷组(1g/kg)和2-溴丙烷组(1g/kg),连续腹腔注射1周。对大鼠的附睾进行精子数量和形态的评价;运用HE和PAS染色对睾丸的病理变化进行评价;运用TUNEL染色法和caspase-3活性的免疫组化法对大鼠睾丸的凋亡损伤进行评价;利用化学比色法对附睾和睾丸的GSH、MDA、SOD、GST、GSH-RD、GSH-PX和CAT等氧化应激指标进行测定;实时定量PCR法对凋亡相关基因Fas、Bax、Bcl-2、P53和FasL的mRNA表达水平进行测定。2. 27只SPF级SD大鼠随机分为三组:对照组,1-溴丙烷组(1g/kg)和2-溴丙烷组(1g/kg),连续腹腔注射2周。每组随机选择3只进行生殖病理学和凋亡损伤的评价,其余6只进行分子生物学检测。实时定量PCR法对DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的mRNA表达水平进行测定,利用ELISA法对HDAC和HAT的活性进行测定。3.运用SPSS 10.0和JMP7.0统计软件进行分析,对各变量进行方差齐性检验,方差齐的定量资料采用ANOVA方差分析,各组之间的比较使用LSD法。方差不齐的定量资料采用Krusakal-Wallis进行分析,各组之间的比较使用Mann-Whitney法,以α=0.05为检验水准。结果1.溴丙烷两种同分异构体1周暴露实验溴丙烷两种同分异构体的暴露使大鼠的体重和生殖器重量都有下降的趋势。1-BP暴露使大鼠的体重低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。2-BP暴露使大鼠睾丸的重量低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,溴丙烷两种同分异构体的暴露使大鼠附睾精子的绝对数量和相对数量减少,但只有2-BP暴露使附睾的精子数量减少有统计学意义(P<0.05)。在精子形态方面,1-BP和2-BP都可以使精子形态异常的比例增加,1-BP的暴露主要表现在使精子头部异常率增加,尤其是香蕉头的比例。2-BP的暴露主要表现在无尾精子和头部异常的精子比例增加。精子涂片的多重染色结果也显示,溴丙烷两种同分异构体的暴露使精子的数量明显减少,精子中无尾精子和头部异常精子比例增加。HE染色的病理结果显示2-BP的1周暴露使大鼠睾丸的生殖细胞减少,生精小管发生萎缩坏死,并有空泡的出现;而1-BP的病理切片中,未见生精小管和生殖细胞发生明显的异常改变。PAS染色结果显示,在大鼠生精小管的精子发育IX-XI期中,1-BP的病理切片中可观察到有19级精子的释放延迟,而在2-BP的病理切片中未发现精子释放延迟的现象。TUNEL标记反应的结果显示:对照组大鼠睾丸的生精小管中很少出现阳性细胞。1-BP暴露使生精小管平均每管的阳性细胞数、阳性小管所占总生精小管的百分比和凋亡指数(阳性生精小管%*平均每管阳性细胞数)增加,但差异无统计学意义(P>0.05,P>0.05,P>0.05)。2-BP暴露组大鼠的生精小管底部可见精原细胞和粗线期精母细胞的凋亡明显增加,与对照组相比平均每管的阳性细胞数、阳性小管的百分比和凋亡指数有明显升高(P<0.05,P<0.05,P<0.01);与1-BP组相比,阳性小管的百分比和凋亡指数也有明显升高(P<0.05,P<0.01)。在对照组的生精小管中,Caspase-3 active阳性的生殖细胞较少出现,但1-BP和2-BP的暴露都使大鼠睾丸的Caspase-3 active活性增强,2-BP暴露使Caspase-3 active活性的增强更明显。与对照组相比,1-BP和2-BP可使平均每生精小管的阳性细胞数和caspase-3阳性百分比有明显的升高(P<0.05,P<0.05;P<0.01,P<0.01);与1-BP相比,2-BP也可使平均每生精小管阳性细胞数和caspase-3阳性百分比有明显的升高(P<0.01,P<0.01)。1-BP暴露使大鼠睾丸GR的活性和附睾MDA含量、SOD活性的增加有统计学意义(P<0.05)。2-BP的暴露使睾丸和附睾的MDA含量升高和GSH含量下降,附睾组织的GST和GR活性下降有统计学意义(P<0.05)。1-BP和2-BP暴露可使大鼠睾丸的p53、Bax和Bcl-2基因的mRNA表达水平有下调的趋势,但只有2-BP暴露使三基因的表达水平下调有统计学意义(P<0.05)。1-BP和2-BP的暴露可使大鼠睾丸的Fas和FasL基因的mRNA表达水平也有下调的趋势,但下调的水平无统计学意义。溴丙烷两种同分异构体的暴露对大鼠睾丸Fas/FasL和Bax/Bcl-2的mRNA表达水平比例没有影响。2.溴丙烷两种同分异构体2周暴露实验1-溴丙烷暴露使大鼠睾丸的甲基化转移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b mRNA水平有下降的趋势,但相对于对照组无统计学意义。2-溴丙烷暴露使大鼠睾丸的DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的mRNA水平下降具有统计学意义(P<0.001;P<0.05;P<0.001);相对于1-BP组,2-BP暴露下调了DNMT1和DNMT3b的mRNA水平(P<0.001;P<0.001)。同对照组相比,1-BP暴露对大鼠睾丸的HAT和HADC活性水平无影响,2-BP暴露使大鼠睾丸HAT活性水平升高(P<0.05),对HDAC活性水平影响无统计学意义。与1-BP组相比,2-BP组大鼠睾丸的HAT活性升高也有统计学意义(P<0.05)。结论溴丙烷两种同分异构体可能具有不同的作用靶部位和作用机理。1-BP的生殖毒性可能是通过影响精子的成熟、获能或其他原因,从而导致精子释放的延迟和精子形态的异常,生殖细胞的凋亡和坏死可能不是主要的原因。生精小管的精原细胞和精母细胞可能是2-BP的靶细胞,通过精原细胞和精母细胞的凋亡,2-BP可以引起生殖细胞的坏死和减少,从而导致睾丸重量的下降、精子数的减少和异常精子比例的增高。另外,此次研究结果也提示2-BP的生殖毒性可能高于1-BP的毒性;在溴丙烷的生殖毒性作用中,尤其是2-BP的毒性作用中,DNMT的mRNA水平和HDAC及HAT的活性可能起到一定的作用。