此研究以本实验室通过多年筛选得到的、具有再生能力的紫花苜蓿品种“保定苜蓿”为基因转化的受体材料,通过根癌农杆菌介导法,将从拟南芥中克隆获得的调控植物对逆境反应的DREB1C转录因子基因转化到“保定苜蓿”中,以期获得具有更好抗逆性状的苜蓿新品种。本研究,将实验室原有的苜蓿组织培养配方进行了改良,从而获得了苜蓿组织培养再生植株的有效方案,同时,将原有的用于转化苜蓿的表达载体进行了改造,以便对再生的转基因植株进行筛选。初步鉴定表明,目的基因DREB1C转录因子基因已经整合到了苜蓿基因组上。本研究的主要结果如下:建立了一套用于保定苜蓿组织培养的高效再生体系。对作为外置体的材料进行了选择,分别选用下胚轴和子叶作为外植体,通过对其愈伤组织的诱导率进行比较,得出了下胚轴比子叶作为外植体能获得更好的效果。在愈伤组织诱导阶段,外植体被放在UM培养基和改良的SH培养基上,培养30天后,比较两种培养基上的愈伤组织的诱导率,从而进行不同培养基对于诱导愈伤组织能力的比较。改良的SH培养基相对于UM培养基对于愈伤组织的诱导更有效。同时还得出,在愈伤组织诱导阶段,2,4-D起到了关键的作用,KT能辅助2,4-D发挥更好的作用。在胚状体诱导阶段,不同浓度的KT和水解酪蛋白被加入到培养基内,以比较它们在胚状体的起始和成熟过程中所起的作用。培养20天以后,在含有0.2 mg/L KT和2 g/L水解酪蛋白的UM培养基上,得到了最大的胚状体诱导率。水解酪蛋白的加入提高了胚状体的成熟率和质量。含有15 g/L蔗糖的1/2MS培养基对于生根是很有效的。为了便于转基因植株的分子检测,利用重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR, SOE PCR)方法克隆来自于水母的绿色荧光蛋白基因(GFP)和来自于拟南芥的目的基因DREB1C转录因子,并对其进行改造从而获得了融合基因。通过酶切和连接反应,将融合基因构建到表达载体pCAMBIA1301上,获得了具有DERB1C和GFP基因的重组表达载体pDR1- GFP,酶切和测序结果表明,该融合基因与预期相符。本实验所用的DREB1C转录因子基因,是在35s启动子的调控下、从拟南芥中克隆的、植物调控其自身抵抗外界逆境的信号基因。用根癌农杆菌介导的遗传转化法,将其整合到苜蓿基因组上。苜蓿的外植体放于含有目的基因及潮霉素抗性基因的载体pCAMBIA1301的农杆菌菌株GV3101中侵染。共培养3天后,外植体被转移到愈伤组织诱导培养基上(改良的SH培养基),培养基中含有2mg/L 2,4-D、0.2mg/L KT、30 mg/L潮霉素和300 mg/L头孢霉素。培养大约3周以后,潮霉素抗性的愈伤组织被转移到胚状体诱导培养基上(UM培养基),培养基含有0.6 mg/L KT、30 mg/L潮霉素和300 mg/L头孢霉素。大约4周以后,胚状体和小的植株就会从这些愈伤组织的表面生长出来。最后,成熟的胚状体和幼嫩的植株被转移到1/2 MS培养基上,以完成生根。经过PCR和RT-PCR分析得出,DREB1C基因已经整合到了再生植株的基因组上。