riceXIP（Rice xylanase inhibiting protein）是近年来在水稻中新发现的一种XIP型木聚糖酶抑制蛋白,它对不同来源11家族内切木聚糖酶催化活性的抑制作用差异较大。本文从日本晴水稻（Oryza sativa）基因组克隆得到木聚糖酶抑制蛋白基因ricexip,将该基因分别在Escherichia coli BL21（DE3）和Pichia pastor GS115中重组表达,测定重组抑制蛋白对不同来源11家族木聚糖酶活性的抑制作用,采用内源荧光光谱,圆二色谱和分子对接模拟研究了重组抑制蛋白和木聚糖酶的作用方式,基于酵母双杂系统分析该抑制蛋白与木聚糖酶在细胞内的互作效应,初步阐明抑制蛋白与木聚糖酶之间的相互作用机制。1.以日本晴水稻（Oryza sativa）基因组为模板,通过设计特异引物克隆得到的ricexip,该基因的大小为873 bp,编码290个氨基酸残基,N-末端包含由28个氨基酸编码的信号肽,理论分子量为32.0 kDa。将ricexip与pCold TF连接并转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞,筛选出阳性表达子ColdXIP-5。ColdXIP-5在15°C下培养,并添加IPTG诱导,重组抑制蛋白reEriceXIP被分泌到培养基中,同时也存在于细胞内;采用Ni亲和层析对其纯化,SDS-PAGE分析结果表明reEriceXIP分子量约为87.8 kDa。reEriceXIP对11种内切木聚糖酶均有一定的抑制活性,其中对TfxA_CD214、reBaxA454和TfxA_CD526的抑制活性较高。reEriceXIP与这三种酶的较合适抑制条件是在40°C下反应30 min。抑制动力学测定结果显示:随着抑制蛋白剂量的增加,木聚糖酶的K_m逐渐增加,而V_{m a x}保持不变,由此可知该抑制蛋白与木聚糖酶之间存在竞争性抑制;计算得到其抑制常数K_i为7.0 nM。采用HPLC-ELSD检测木聚糖的水解产物,结果表明,reEriceXIP抑制了TfxA_CD214、reBaxA454和TfxA_CD526对山毛榉木聚糖的水解作用,但并没有影响水解产物的类型。2.ricexip与穿梭载体pPICZαA连接并线性化后转化P.pastoris GS115感受态细胞,筛选获得阳性毕赤酵母工程菌PPricexip1。PPricexip1在30°C下培养,添加甲醇诱导144小时,其发酵上清蛋白浓度和菌体浓度达到最大值。重组抑制蛋白rePriceXIP被分泌到培养基中,采用Ni亲和层析对其纯化,经SDS-PAGE分析得知rePriceXIP分子量约为44.0 kDa。rePriceXIP对11种内切木聚糖酶均有一定的抑制活性,其中对TfxA_CD214、reBaxA454和TfxA_CD526的抑制活性较高,rePriceXIP与这三种酶的较合适反应条件是40°C下反应30 min。抑制动力学测定显示,随着抑制蛋白剂量的增加,木聚糖酶K_m逐渐增加,而V_{m ax}保持不变,由此可知该抑制作用为竞争性抑制,计算得到K_i为12.3 nM。3.使用荧光光谱结合圆二色谱分析在大肠杆菌中重组表达的reEriceXIP和在毕赤酵母中重组表达的rePriceXIP与木聚糖酶TfxA_CD214,reBaxA454和TfxA_CD526之间的作用机制,内源荧光光谱显示抑制蛋白-酶之间发生了静态荧光猝灭现象,结合公式推测出两种抑制蛋白（reEriceXIP和rePriceXIP）与这三个木聚糖酶之间均存在一个结合位点,且结合作用通过氢键起作用。使用SWISS-MODEL软件建立riceXIP与BaxA的同源结构模型,并使用ZDOCK SERVE模拟riceXIP与BaxA分子对接,结果显示riceXIP中的特殊结构∏-shaped loop（Lα₄β₅）的残基插入到了木聚糖酶BaxA的催化活性区域,对riceXIP-BaxA复合物分子间H键分析结果表明,riceXIP的R148氨基酸残基和BaxA的E78,E172,N35和Y80四个氨基酸残基之间存在较强的H键作用,且E78和E172为BaxA的两个催化活性位点。4.将ricexip与pGBKT7载体连接并转化酵母AH109感受态细胞;将克隆得到的5种木聚糖酶基因（tfxa_cd,tfxa_cd 214,tfxa_cd526,baxa和baxa454）分别与pGADT7载体相连并转化酵母Y187感受态细胞。随后将两种酵母细胞进行双杂交,观察菌落生长情况,结果显示抑制蛋白与木聚糖酶存在互作效应。β半乳糖苷酶的酶活力测定结果表明互作强度为:riceXIP/TfxA_CD526>riceXIP/TfxA_CD214>riceXIP/TfxA_CD;riceXIP/reBaxA454>riceXIP/reBaxA。