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多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)是育龄妇女最常见的内分泌代谢紊乱性疾病,发病率高达5%～10%。其临床表现高度异质,表现为:生殖障碍(月经稀发、闭经、不孕、多毛、肥胖和孕期并发症增加);代谢紊乱(糖耐量异常、Ⅱ型糖尿病、高血压、心脑血管疾病及脂代谢异常);心理疾病(抑郁、焦虑、生活质量下降)。从上世纪60年代起至今对其病因及病理生理改变进行了大量研究,目前还不能明确阐明其发病机理。存在以下假说:1、卵巢或肾上腺合成类固醇激素酶的功能异常。2、下丘脑分泌释放促性腺激素释放激素(GnRH)的频率和波幅增强。3、胰岛素抵抗和代偿性高胰岛素血症。近20年认为胰岛素抵抗和代偿性高胰岛素血症在PCOS的发病中起着重要的作用。胰岛素抵抗不仅引起组织慢性轻度炎性改变,导致代谢性紊乱,还可引起生殖障碍。胰岛素水平增加:与LH协同作用增加卵巢合成分泌雄激素;减少肝脏分泌性激素结合球蛋白,相对地增加游离睾酮的浓度;和胰岛素样生长因子(IGF)共同作用,刺激卵巢细胞雄激素合成增多。生理状态下,胰岛素与其受体的a亚基结合,诱发β亚基的酪氨酸基自身磷酸化,并激活胰岛素受体(InsR)的酪氨酸激酶和胰岛素受体底物(IRS)的多个酪氨酸残基磷酸化,促发其下游信号传导联级反应。如胰岛素受体及其底物丝氨酸磷酸化增强,酪氨酸磷酸化降低,胰岛素作用信号受阻即胰岛素抵抗。研究表明PCOS患者脂肪组织、肌肉、肝脏等多种脏器存在胰岛素抵抗,表现为胰岛素受体数量及其底物磷酸化改变,致胰岛素作用障碍。PCOS卵巢颗粒细胞糖原的合成呈抵抗状态,可被胰岛素增敏剂所纠正。PCOS卵巢黄体颗粒细胞,胰岛素刺激葡萄糖代谢产物乳酸产生减少,丙酮酸消耗增加,提示卵巢颗粒细胞胰岛素的作用受损。PCOS卵巢颗粒细胞是否存在胰岛素受体底物丝氨酸磷酸化(IRS-1SerP)增强,导致胰岛素作用信号传导障碍?目前尚未见文献报道。临床上应用胰岛素增敏剂二甲双胍(Met)治疗PCOS能增加外周组织胰岛素敏感性,降低血胰岛素水平,间接降低雄激素,有助于卵巢恢复排卵,且纠正代谢紊乱。Met治疗PCOS的分子作用机理不明。二甲双胍是否改善卵巢颗粒细胞胰岛素作用受损,且直接抑制卵巢颗粒黄体细胞雌激素合成酶细胞色素P450芳香化酶(P450arom)的表达,降低雌激素的产生,有待实验进一步证实。AMPK信号通路是调节细胞能量状态的中心环节,被称为“细胞能量调节器”。AMPK是三聚体酶,由催化性亚单位α和两个调节性亚单位β、γ。AMPK活性来自α亚单位酪氨酸172残基磷酸化。AMPK酶可被组织缺氧、激素、药物所激活。二甲双胍是否增强AMPK磷酸化(pMAPK),增加颗粒细胞的能量供给?值得研究。目的:1、二甲双胍是否改善PCOS患者辅助生殖技术的临床效果;2、Met是否下调PCOS卵巢颗粒细胞IRS-1基因及IRS-1Ser磷酸化表达,改善颗粒细胞胰岛素抵抗;3、Met是否上调PCOS卵巢颗粒细胞MAPK基因及pMAPK表达;4、Met能否直接抑制PCOS卵巢黄体颗粒细胞P450芳香化酶表达,抑制雌激素的合成,为临床治疗提供理论依据。方法:1、收集2006.10～2009.02在安医大一附院生殖中心行未成熟卵体外成熟培养技术(IVM)治疗的PCOS患者92个周期,其中给以二甲双胍(1000mg/日×3月)预治疗44例;同期行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)的PCOS患者124个周期,其中予以二甲双胍(Met:1000mg/日×3月)预治疗66例。分析总结两组临床资料:性激素水平、空腹血糖及胰岛素、获卵数、体外成熟率、受精率、种植率、子宫内膜厚度、临床妊娠率、卵巢过渡刺激综合症(OHSS)率。2、收集PCOS患者IVM时卵巢颗粒细胞分别加入Met:10uM、100uM及200uM孵育36h后蛋白免疫印迹(Western Blot)和实时定量RT-PCR检测IRS-1Ser及AMPK磷酸化和mRNA的表达。3、收集PCOS患者二甲双胍(1000mg/日×3月)治疗组和对照组行IVM治疗取卵时的颗粒细胞Western Blot和RT-PCR检测颗粒细胞IRS-1SerP及pMAPK蛋白和mRNA的表达。4、收集PCOS患者二甲双胍(1000mg/日×3月)治疗组和对照组行IVF时黄体颗粒细胞,检测P450arom蛋白和mRNA的表达。结果:1、二甲双胍预治疗PCOS患者:增加了IVM-ET及IVF-ET的临床妊娠率(34.1%±12.5%,39.40%±20.69 %),与对照组比较有统计学差异;显著减少了PCOS患者行IVF-ET治疗时OHSS的发生率(9.09%±22.41%,P<0.05)。2、体外培养的PCOS卵巢颗粒细胞加入Met 10 uM、100 uM、200 uM,IRS-1基因表达分别为:2.1401E5±32365;1.7560E4±1362;1.2849E4±1118。10uM组和100uM组及10uM和200uM的IRS-1基因表达差异有统计学意义,100uM组和200uM的IRS-1基因表达无差异。AMPK基因表达分别为:1.5547E3±172;1.1886E4±2509;1.0716E6±1.61560E5。10 uM组和100uM组的AMPK基因表达无差异,10uM和200uM及100uM组和200uM的AMPK基因表达差异有统计学意义。3、Met预治疗PCOS收集体内卵巢颗粒细胞(Met组)与对照组比较:IRS-1基因表达: 33986±7174 vs 34534±7796,两组无显著差异(t=1.262,P =0.224)。AMPK基因表达:1.1055E6±1.34019E5 vs 1.4205E3±196,Met组与对照组比较有差异(t=34.938,P<0.05)。两组IRS-1Ser磷酸化蛋白:0.30±0.07 vs 1.17±0.15,有统计学差异(t=22.87,P<0.05)。4、PCOS组(A)、Met预治疗组(B)、体外Met培养组(C)P450基因表达分别为:1.0225E7±2.56166E6;1.6154E4±1446;1.4817E4±1452。方差分析示PCOS组与其他两组比较有统计学差异(P<0.05)。三组P450蛋白表达分别为:1.47±0.30;0.57±0.23;0.58±0.21。A组和C组及A组和B组P450蛋白表达差异有统计学意义。结论:1、二甲双胍预治疗增加了PCOS患者IVM-ET及IVF-ET的临床妊娠率,减少了OHSS的发生。2、二甲双胍加入体外培养的PCOS颗粒细胞,IRS-1基因表达随剂量增加,而逐渐下降,但AMPK基因的表达随剂量增加而增加。Met预治疗的体内卵巢颗粒细胞,其IRS-1Ser磷酸化程度降低,提示Met改善卵巢颗粒细胞胰岛素敏感性,并激活AMPK途径,增加细胞的能量供给。3、体内、体外实验证实:Met降低PCOS颗粒细胞P450arom蛋白和mRNA的表达,减少雌激素的合成,预防OHSS的发生。