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第一章DNA损伤修复因子CSB-PGBD3在卵巢早衰发病中的作用机制研究第一节中国汉族卵巢早衰家系的全外显子组测序研究目的：目前卵巢早衰的遗传学研究主要依赖于模式动物及散发性POF病例的基因突变筛查,但进展缓慢。基因组学技术的发展为寻找疾病易感位点和候选基因提供了更高效精准的手段,因此,本研究拟通过高覆盖率的全外显子组测序技术,以POF家系为研究对象,希望发现新的POF致病基因。方法：在中国汉族非近亲婚配家系POF-1中分别选取POF患者、致病基因疑似携带者和非携带者,使用illumina测序平台进行全外显子组测序,所获结果与hg19数据库进行序列对比,并按照常染色体显性遗传方式进行候选基因筛选,然后在其他成员中通过Sanger测序进行验证,并在432例散发性POF患者和400例正常对照中进行候选基因突变筛查。结果：在POF-1家系的全外显子组测序中,我们发现了符合常染色体显性遗传规律的错义突变PGBD3 c.2237G>A (p.G746D)。由于转座子基因PGBD3能够插入CSB基因形成CSB-PGBD3融合基因,因此我们在432例散发性POF患者和400例正常对照中对CSB-PGBD3进行了基因突变筛查,继而又发现了杂合错义突变C.3166G>A (p.V1056I)和杂合无义突变c.643G>T (p.E215X)。结论：首次发现CSB-PGBD3基因突变与家族性和散发性POF密切相关,为POF致病机制研究提供了新的方向。高通量的全外显子组测序技术也为POF的遗传学研究提供了有力的技术支持。第二节CSB-PGBD3基因突变对DNA损伤修复功能的影响目的：通过对POF-1家系进行全外显子组测序研究,我们发现了POF候选致病基因CSB-PGBD3。PGBD3是灵长类动物特有的转座子基因,它可以插入CSB基因形成CSB-PGBD3融合基因,并表达CSB-PGBD3融合蛋白。有学者发现CSB-PGBD3融合蛋白参与DNA损伤的转录耦联修复,但该基因在生殖细胞中的作用及其对卵巢功能的影响尚无报道。本课题拟通过研究CSB-PGBD3融合蛋白在卵巢组织中的表达情况及突变对其DNA损伤修复功能的影响,探讨CSB-PGBD3与卵巢早衰的关系及致病机制。方法：利用人和恒河猴的卵巢组织对PGBD3和CSB-PGBD3融合蛋白进行卵巢组织定位。通过clonogenic survival实验检测CSB-PGBD3基因突变对细胞存活的影响。通过laser irradiation和H2O2损伤实验明确CSB-PGBD3的DNA损伤修复功能。通过对比野生型和突变型CSB-PGBD3与RNAPol Ⅱ等DNA损伤修复因子的相互作用,探讨CSB-PGBD3参与DNA损伤修复的具体机制及突变对其功能的影响。结果：通过在卵巢组织中的定位研究,我们发现PGBD3和CSB-PGBD3融合蛋白在灵长类动物各级卵泡的卵母细胞核中特异性表达。通过多种DNA损伤修复实验,我们发现CSB-PGBD3能够通过与RNApol Ⅱ结合,参与DNA损伤的转录耦联修复机制。此外,CSB-PGBD3能够上调XPA、DDB1等DNA损伤修复因子的表达,促进更广泛的DNA修复。我们所发现的3种突变均不同程度地影响了CSB-PGBD3的DNA损伤修复功能。结论：CSB-PGBD3融合蛋白是卵母细胞重要的DNA损伤修复因子,CSB-PGBD3基因突变导致的卵母细胞DNA损伤修复功能障碍可能是POF的致病机制之一。第二章DNA损伤修复因子MSH5在卵巢早衰发病中的作用机制研究目的：MSH5是重要的减数分裂相关基因,促进同源重组过程中Holliday Junction的形成和稳定,对第一次减数分裂前期联会复合体的形成和配子发生具有重要作用。本研究的目的是探讨MSH5基因突变与卵巢早衰的相关性及其致病机制。方法：通过对中国汉族非近亲婚配家系POF-2进行全外显子组测序,并在432例散发性POF患者中进行验证,我们发现了MSH5基因突变。利用RT-PCR和免疫组化在人和恒河猴的卵巢组织中进行MSH5表达定位；通过clonogenic survival实验检测野生型和突变型MSH5蛋白对细胞存活的影响；利用依托泊苷(ETO)诱导细胞发生DNA双链断裂,并通过检测γH2AX水平,分析突变对MSH5的DNA损伤修复功能的影响；同时,结合文献信息和蛋白结构预测模型,分析MSH5基因突变对卵巢功能的影响及其在POF发病中的作用。结果：通过对POF-2家系进行全外显子组测序研究,我们发现了位于MSH5基因的纯合错义突变c.1459G>T(p.D487Y),散发性POF患者中未发现该突变。通过蛋白结构预测模型分析,我们发现突变p.D487Y位于MSH5的DNA结合功能域内,该位点从酵母到人类高度保守,酵母的同源位点突变可严重影响孢子生成。通过在卵巢组织中的定位研究,我们发现MSH5蛋白不仅在胚胎期的卵巢组织中高表达,而且在发育期卵泡的卵母细胞、颗粒细胞和卵泡膜细胞中表达。野生型MSH5蛋白能够促进ETO诱导的DNA双链损伤的修复,而突变型MSH5的功能丧失。结论：MSH5基因突变与家族性POF密切相关。MSH5广泛表达于卵巢的卵母细胞及其支持细胞中,MSH5基因突变可能通过DNA同源重组修复机制障碍引起卵母细胞及其支持细胞的过度凋亡,卵泡异常闭锁,最终导致卵巢早衰的发生。第三章FMR1基因前突变与中国汉族卵巢早衰的相关性研究目的：卵巢早衰的遗传学病因有很大的地域和种族差异。FMR1基因前突变在高加索散发性POF患者中的发生率为3.3%-6.7%,被认为是POF的重要致病基因。FMR1前突变携带者的后代容易发生FMR1全突变,导致脆性X综合征的发生,因此POF患者被推荐进行FMR1突变筛查。但是,FMR1前突变在中国汉族POF人群中的携带情况尚无报道,FMR1突变筛查的必要性有待探讨。因此,本研究拟通过在中国汉族POF患者中进行FMR1基因突变筛查,明确FMR1前突变与中国汉族POF的相关性,为遗传咨询和生育指导提供理论依据。方法：选取379例中国汉族散发性POF患者和402例正常对照参与实验,以外周血基因组DNA为模版,使用荧光标记引物进行PCR扩增,并通过毛细管电泳检测FMR1 5’UTR的CGG重复次数。同时,分析闭经年龄与FMR1基因CGG重复次数的相关性。结果：FMR1前突变在中国汉族散发性POF患者中的发生率仅为0.5%(2/379),远低于高加索人群。FMR1中间型(CGG重复41-54次)在POF患者中的发生率略高于正常对照,但差异无统计学意义(2.9% vs.1.7%,P=0.343)。POF患者的FMR1两等位基因均比正常对照多一个CGG重复(allele-1:29.7 vs. 28.8, P<0.001; allele-2:32.6 vs.31.5, P<0.001)。携带FMR1纯合突变型的POF患者比正常基因型携带者的闭经年龄提前约4-6年(hom-high/high vs. norm： 20.4±4.8 vs.24.7±6.4, P<0.01; hom-low/high vs. norm:18.7±1.7 vs.24.7±6.4, P<0.01)。结论：FMR1基因前突变不是中国汉族POF的常见病因,然而,当FMR1两等位基因的CGG重复次数同时超出正常范围(26-34)时,携带者的卵巢功能可能出现过早衰竭。