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p53是最重要的抑癌基因之一,通过影响编码细胞周期相关蛋白质基因的表达来调控细胞周期的G1和G2/M期阻滞,如果DNA损伤严重不能修复,则诱导细胞发生凋亡。p53抑癌功能丧失的主要方式是基因突变,但有50%的肿瘤具有野生型p53,这些表达野生型p53的肿瘤中p53蛋白失活的机制多年来一直困扰着人们。最近p53凋亡刺激蛋白(ASPP)家族的发现为解决这一难题开辟了新的思路。
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是目前最有效的基因沉默技术,能特异性抑制靶基因的转录,进而下调相应蛋白水平及功能。目前RNAi在基因功能、抗肿瘤和抗病毒基因治疗等方面的研究已取得进展。
目的:
通过比较p53遗传背景不同的非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株A549(p53野生型)和NCI-H157(p53突变型)中iASPP的mRNA和蛋白表达,对比p53遗传背景不同的NSCLC细胞株中iASPP的表达情况。同时应用RNA干扰技术下调iASPP的表达,观察两株细胞iASPP基因的干扰效果及其对细胞增殖及凋亡等生物学功能的影响,初步探讨iASPP在p53遗传背景不同的肺癌细胞株中表达的差异及其生理机制,为开辟iASPP介导的RNA干扰治疗提供实验基础。
方法:
构建iASPP的siRNA真核表达载体,鉴定证实序列的正确性;利用脂质体法将iASPP干扰质粒及阴性对照质粒转染入2株细胞中;荧光显微镜对转染后细胞进行拍照,观察转染效果;通过RT-PCR及Western Blot实验检测细胞株中iASPP mRNA和蛋白质表达,对比p53遗传背景不同的NSCLC细胞株中iASPP的表达差异;同时检测转染前后iASPPmRNA及蛋白质表达的变化;同时辅以透射电镜检测细胞表观状态,观察转染前后细胞凋亡百分比。
结果:
1.成功构建iASPP的siRNA真核表达载体,经测序、酶切鉴定证实序列完全符合要求。
2.A549对照组的iASPP mRNA及蛋白表达均高于NCI-H157,即NSCLC细胞株中p53野生型细胞(A549)iASPP表达高于p53突变型的细胞株(NCI-H157)。
3.两组iASPP干扰质粒均可使两株细胞iASPPmRNA及蛋白表达下降,其中iASPP-sil对A549的mRNA和蛋白抑制率分别为58.3%、46.8%,对NCI-H157的mRNA和蛋白抑制率分别为41.3%、34.4%;iASPP-si2对A549的mRNA和蛋白抑制率分别为53.9%、46.8%,对NCI-H157的mRNA和蛋白抑制率分别为45.8%、34.2%。
4.透射电镜下观察,未经处理的肿瘤细胞核圆、形态规则,核仁清晰,染色质分布均匀,细胞膜完整;采用RNA干扰后,各干扰组均可见凋亡细胞增多。可见核膜皱缩内陷不规则,染色质边集,呈新月状分布于核膜下,亦可见染色质浓缩、边集明显。
结论:
iASPP在p53突变型NSCLC细胞株NCI-H157中的表达比野生型细胞株A549中低。p53促凋亡抑制基因iASPP的siRNA干扰质粒转染入NSCLC细胞株A549和NCI-H157,可以使iASPP mRNA转录后降解,进而引起功能性iASPP蛋白表达下调,转染质粒后两株细胞凋亡均增加。本实验通过RNA干扰iASPP表达为NSCLC的治疗提供了新的策略。