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背景:动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是多种心脑血管疾病的主要病理基础,是一种以粥样斑块为显著特征的慢性病理过程,在中医理论上属于“痰”、“瘀”的范畴,属于艾灸疗法的适应症范围。艾灸疗法改善AS的临床及机制研究已有大量报道,为艾灸抗AS的安全性和有效性提供了一定的科学依据。现代研究证明,艾灸可以通过改善AS过程中的脂质代谢、炎症反应、氧化应激、血小板活化以及内皮细胞功能多个方面,起到多靶点治疗AS的作用。艾烟是艾灸起效的重要因素之一,课题组前期研究也证明了艾烟在抗AS中不可替代的作用。细胞自噬是机体中的一项重要促存活机制,与AS各种发病机制均有深入的联系,也是近年来抗AS治疗中新的靶点和焦点。学者们认为自噬不足及过度自噬都会对AS的病理进程产生不利影响,这一现象反映了中医理论中阴阳平衡、对立统一的理念,同时自噬在微观层面上改善能量代谢、清除病理产物的作用与气的“气化”和“驱邪外出”等功能具有高度一致性。因此,已有不少学者着手研究中医药疗法调控自噬,改善心血管疾病的机制,并且取得了一定的成果。针刺、艾灸调控自噬防治心血管疾病的研究已有报道,但直接观察艾灸调控自噬对AS的研究还亟待开展。文献报道及课题组前期研究发现,艾灸对自噬通路及相关自噬蛋白展现出确切的调控作用,课题组预实验结果也体现了艾灸对AS过程中自噬的确切调控作用。基于上述基础,我们提出假说,艾灸及艾烟可以通过调控AS过程中的自噬功能,来实现防治AS的作用。目的:观察艾灸及艾烟两种干预手段对AS动物模型的影响,从病理改变、脂质代谢、斑块稳定性等方面探讨艾灸及艾烟防治AS的效应,然后通过对自噬特异性、自噬信号通路及凋亡水平等方面指标观察,从自噬角度探讨艾灸防治AS的作用机制。方法:54只8周龄ApoE载脂蛋白基因敲除小鼠按照随机数字表方法随机分为三组:模型组、艾灸组和艾烟组。18只同龄C57BL/6小鼠作为空白对照。艾灸组小鼠每日抓取,固定,予以艾灸膻中穴治疗,每次20 min,每日1次,每周6次,共干预12周。艾烟组小鼠每日接受固定浓度的艾烟暴露。模型组和空白组每日抓取固定,但不予任何干预。采用血液生化方法检测血脂四项(TC、TG、HDL、LDL),采用Elisa法检测VLDL、ApoA1及ox-LDL,分别使用油红“O”和HE染色法观察主动脉病理切片。采用Masson染色法处理主动脉切片,计算ELA、CA、CD68、FCT、Ⅵ等斑块稳定性指标。采用免疫组化法检测主动脉内TNF-α、P38MAPK、NF-κB蛋白表达,采用Elisa法检测主动脉内MMP-2、MMP-9、TIMP-1。使用透射电镜观察血管内皮自噬小体数目,使用 Western blot 法检测小鼠主动脉 P62、Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5、Atg12 蛋白表达,使用免疫荧光法检测小鼠主动脉及肝脏P62、Beclin-1、LC3-Ⅱ表达。使用Western blot法及RT-PCR方法观察自噬信号通路p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、PI3K在蛋白及mRNA水平上的的表达,使用Western blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-3表达。结果:1.AS病理进程及血脂水平模型组小鼠经过12周高脂喂养,体内存在较为明显的AS病变(血脂紊乱,AS斑块形成);与空白组相比,小鼠血清TC(P<0.01)、TG(P<0.01)、LDL(P<0.01)、VLDL(P<0.01)显著升高,载脂蛋白ApoA1(P<0.05)及HDL(P<0.01)含量显著下降。以上AS常规指标结果提示本次研究AS模型建立成功。相比于模型组,经过12周的干预治疗,艾灸组小鼠体内AS病理改变减轻(血脂紊乱减轻、主动脉斑块缩小、内皮损伤改善);艾灸组小鼠血清TC(P<0.01)、TG(P<0.01)、LDL(P<0.05)、VLDL(P<0.01)显著下降,载脂蛋白ApoA1及HDL含量有升高趋势,但无显著差异(P>0.05)。艾烟组小鼠体内AS病理改变减轻(血脂紊乱减轻、主动脉斑块缩小、内皮损伤改善);艾烟组小鼠血清 TC(P<0.05)、TG(P<0.05)、VLDL(P<0.05)显著下降,LDL含量有下降趋势,但无显著差异(P>0.05)。载脂蛋白ApoA1及HDL含量有升高趋势,但无显著差异(P>0.05)。2.斑块稳定性相比于模型组,经过12周的干预治疗,艾灸组小鼠体内CA(P<0.01)、FCT(P<0.01)水平显著升高,ELA(P<0.01)水平显著下降,斑块易损指数Ⅵ(P<0.05)显著降低;炎症因子 TNF-α(P<0.05)、NF-κB(P<0.05)、MMP-9(P<0.05)、MMP-2(P<0.05)水平显著下降,TIMP-1(P<0.05)水平显著升高。艾烟组小鼠体内CA(P<0.01)、FCT(P<0.01)水平显著升高,ELA(P<0.01)水平显著下降,易损斑块指数Ⅵ(P<0.05)显著降低;炎症因子TNF-α(P<0.05)、MMP-9(P<0.05)、MMP-2(P<0.05)水平显著下降,TIMP-1水平升高但无统计学差异(P>0.05)。3.自噬特异性相比于模型组,经过12周的干预治疗,电镜下艾灸组小鼠主动脉内皮自噬小体及自噬溶酶体显著增多。Western blot显示艾灸组小鼠主动脉促自噬蛋白Beclin-1(P<0.01)、LC3-Ⅱ/LC-Ⅰ比值(P<0.01)、Atg12(P<0.05)显著升高,Atg5表现出升高趋势,但无统计学差异(P>0.05);自噬抑制蛋白P62(P<0.01)显著降低。免疫荧光显示艾灸组小鼠主动脉Beclin-1(P<0.05)、LC3-Ⅱ(P<0.05)表达显著增强。艾灸组小鼠肝脏内Beclin-1(P<0.05)、LC3-Ⅱ(P<0.05)显著升高,P62 表达无显著差异(P>0.05)。相比于模型组,经过12周的干预治疗,电镜下艾烟组小鼠主动脉内皮细胞自噬小体及自噬溶酶体显著增多。Western blot显示艾烟组小鼠主动脉促自噬蛋白Beclin-1(P<0.01)、LC3-Ⅱ/LC-Ⅰ 比值(P<0.05)、Atg12(P<0.05)显著升高,Atg5 表现出升高趋势,但无统计学差异(P>0.05);自噬抑制蛋白P62(P<0.01)显著降低。免疫荧光显示艾烟组小鼠主动脉Beclin-1(P<0.05)、LC3-Ⅱ(P<0.05)表达显著增强。艾烟组小鼠肝脏内Beclin-1、LC3-Ⅱ、P62表达与模型组无显著差异(P>0.05)。4.PI3K/Akt/mTOR 信号通路结果显示,相比于模型组,经过12周的干预治疗,艾灸组小鼠主动脉内p-Akt/Akt比值(P<0.01)、p-mTOR/mTOR/比值(P<0.01)显著下降,PI3K相对表达量无显著差异(P>0.05)。相比于模型组,经过12周的干预治疗,艾烟组小鼠主动脉内p-mTOR/mTOR/比值(P<0.01)显著下降、p-Akt/Akt比值有下降趋势,但无显著差异(P>0.05),PI3K相对表达量无显著差异(P>0.05)。RT-PCR结果显示,相比于模型组,艾灸组小鼠mTOR mRNA及AktmRNA含量显著下降(P<0.05)。相比于模型组,艾烟组小鼠mTOR mRNA含量显著下降(P<0.05),AktmRNA有下降趋势,但无统计学差异(P>0.05)。5.细胞凋亡蛋白相比于模型组,经过12周的干预治疗,艾灸组小鼠主动脉内Bcl-2蛋白含量显著升高(P<0.05),Caspase-3蛋白含量显著下降(P<0.05)。相比于模型组,经过12周的干预治疗,艾烟组小鼠主动脉内Caspase-3蛋白含量显著下降(P<0.05),Bcl-2蛋白含量有升高趋势,但无统计学差异(P>0.05)。结论:1.艾灸和艾烟都可以改善AS小鼠体内病理进展,减轻炎症反应,纠正血脂紊乱,增强斑块稳定性。2.艾灸和艾烟都可以上调AS小鼠体内自噬水平,艾灸改善自噬是艾灸防治AS的全新靶点。3.艾灸及艾烟可通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路中的相关活性分子,从而提升细胞内自噬水平,起到延缓AS病理进程,改善斑块稳定性的作用。4.艾灸及艾烟通过上调Bcl-2、下调Caspase-3蛋白表达,抑制细胞凋亡,展现出一定的调控自噬/凋亡平衡的作用。5.艾灸和艾烟的调节作用基本一致,在调控血脂方面艾灸干预的效果优于艾烟干预。