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研究背景:前列腺癌是一种欧美国家男性常见的恶性肿瘤,全球死亡率居高不下。2017年,美国大约有164,690个患者被诊断患有前列腺癌,且预计有29,430人死于前列腺癌。前列腺癌的发病率具有明显的地域和种族差异。在中国其发病率低于西方国家,但近年来随着人口老龄化增加呈迅速上升趋势,严重影响男性的健康。生物标记物应用于疾病诊断和治疗已经有50年的历史,目前前列腺特异性抗原(PSA)是唯一应用于临床筛查前列腺癌的标记物。然而前列腺特异性抗原具有特异性低、假阳性高和缺乏肿瘤类型特异性等实质性缺陷,导致了前列腺癌的过度治疗。肿瘤活检是唯一确诊的诊断方法,但是侵入性的检查手段,会对患者造成一定的局部损伤。因此临床上迫切需要更精确的前列腺癌生物标志物。大量的研究证据表明肿瘤的发生发展与癌细胞分泌的外泌体有着密切的关系。纳米囊泡外泌体(exosome)介导癌细胞与其微环境之间的相互作用,并在肿瘤的发生发展中起关键作用。因此对外泌体的研究可以有助于肿瘤的早期诊断,疗效评价以及肿瘤预后分析。多种类型的细胞均可分泌外泌体,而且已经在人体的多种体液如尿液、血清和唾液等检测出外泌体。外泌体的内含物包括蛋白质,脂质,DNA,m RNAs,micro RNAs和lnc RNA等成分。研究证实外泌体可通过这些成分在新生或远距离的位置传递给不同类型的细胞从而影响肿瘤的信号通路。lnc RNA是缺乏编码蛋白质的开放阅读框的内源性转录RNA分子。与mirco RNA不同,lnc RNAs的范围从200到100,000个核苷酸。Lnc RNA可通过招募染色质修饰复合物与mi RNA,m RNA或蛋白质相互作用来调节基因表达,从而影响癌症的六大特征,包括增殖、生长抑制、运动性、永生化、血管生成和多种癌症表型。近年来研究表明,细胞在识别和摄取循环外泌体中lnc RNA之后可促进癌症的发生发展,且外泌体中的lnc RNA可做为早期肿瘤活检和治疗指征。因此鉴定来自外泌体中的关键lnc RNA在前列腺癌发病机制研究中具有重要意义。在本研究中,我们对前列腺细胞癌和非癌对照细胞培养上清液外泌体的lnc RNA进行Array分析,以鉴定差异表达的lnc RNA。结果发现其中一种lnc RNA-DANCR,在前列腺癌细胞来源的外泌体中异常高表达。目前有几个研究小组已经证明DANCR可能在多种生物过程以及癌症进展中起到生物标志物的作用。本研究的目的是探明前列腺癌细胞外泌体中的lnc RNA DANCR的生物学功能及其在前列腺癌发生发展过程中的作用。研究方法:(1)采用超高速离心方法从前列腺良性增生细胞BPH-1、前列腺上皮细胞RWPE-1以及前列腺癌细胞C4-2B、VCa P、PC3培养上清中提取外泌体;(2)采用超高速离心方法从7例前列腺癌病人血清和7例非肿瘤正常血清标本中提取外泌体;(3)采用Nanosight和蛋白质印迹法对前列腺细胞和血清来源的外泌体进行鉴定;(4)通过Human Lnc Finder RT2 lnc RNA PCR Array对前列腺癌细胞和非癌对照细胞来源的exosome中lnc RNAs进行表达差异的分析;(5)通过q RT-PCR验证lnc RNA-DANCR在不同前列腺癌细胞、非癌对照细胞以及血清来源的exosome中表达水平;(6)通过q RTPCR检测lnc RNA-DANCR在前列腺癌细胞和非癌对照细胞中的表达水平;(7)前列腺癌细胞来源exosome处理ST2细胞,收集ST2条件培养基(ST2-CM),采用WST-1检测ST2-CM对PC3细胞增殖的影响;(8)分别用癌细胞exosome和非癌对照细胞exosome处理ST2细胞,并通过q-PCR测定lnc RNA-DANCR在ST2细胞中的表达水平;(9)采用慢病毒sh RNA(sh DANCR)稳定转染前列腺癌细胞系PC3、C4-2B和VCa P,经Puromycin筛选后q RT-PCR检测sh RNA的干扰效率;(10)采用低表达DANCR的癌细胞exosome处理ST2细胞后,检测ST2细胞中DANCR表达水平;(11)低表达DANCR的癌细胞exosome处理ST2细胞后,WST-1法检测ST2-CM对前列腺癌细胞增殖的影响;(12)采用小室侵袭转移实验分析exosome来源DANCR在骨微环境的作用进行功能学研究;(13)前列腺癌细胞exosome处理ST2细胞后,采用蛋白质印迹法和免疫荧光显微镜检测ST2细胞中的自噬活性;(14)癌细胞来源的exosome处理后ST2细胞后,采用RT2Profiler?PCR Array Mouse Cytokines&Chemokines对ST2细胞进行趋化因子和细胞因子筛选。研究结果:一、前列腺癌细胞来源exosome中特异性lnc RNA的筛选1.良性前列腺增生细胞BPH-1、前列腺上皮细胞RWPE-1和前列腺癌细胞C4-2B、VCa P、PC3,以及血清来源的exosome直径大小无显著差异,多数微粒直径在50-150nm之间,粒径均数为100nm。同时Western blot结果显示,exosome均有特异性标记蛋白Alix、HSC70和TSG101的表达。以上结果提示前列腺细胞和血清来源的exosome分离成功。2.通过lnc RNA Array结果分析,发现前列腺癌细胞分泌的C4-2BExo、VCa P-Exo分别与对照细胞分泌的BPH1-Exo比较,同时有5个两倍以上差异表达的lnc RNAs(P<0.05)。其中在前列腺癌细胞exosome中高表达的DANCR、SNHG16和IPW,以及在前列腺癌细胞exosome中低表达的UCA1和RMST。同时C4-2B-Exo、VCa P-Exo分别与对照RWPE-1-Exo比较,也有5个两倍以上表达差异的lnc RNAs,分别是在前列腺癌细胞exosome中高表达的DANCR、SNHG16和IPW、TUG1,以及在前列腺癌细胞exosome中低表达的UCA1。3.通过q-PCR验证,DANCR在对照细胞BPH-1和RWPE-1分泌的exosome中低表达。相反,DANCR在前列腺癌细胞分泌的exosome中表达显著的升高(P<0.001)。这与lnc RNA Array的筛选结果一致。因此,我们将lnc RNA-DANCR作为进一步研究对象。4.通过血清exosome中DANCR分析表明,与非肿瘤正常血清exosome相比,前列腺癌患者血清exosome中DANCR的表达水平显著增加(P<0.05)。二、前DANCR经exosome途径传递至骨微环境中1.采用不同前列腺癌细胞系来源的exosome处理的ST2细胞后,WST-1结果显示,ST2-CM可以促进PC3细胞增殖(P<0.01或P<0.001)。2.q-PCR结果显示,用对照细胞来源的exosome(BPH1-Exo或RWPE1-Exo)处理ST2细胞48h后,ST2细胞中无DANCR表达。但用前列腺癌细胞来源的exosome(VCa P-Exo或PC3-Exo)处理的ST2细胞有DANCR表达(P<0.01)。其中,用C4-2B-Exo处理的ST2具有显著的DANCR高表达(P<0.001)。3.通过q RT-PCR验证,与对照组相比,所有sh RNA构建体使DANCR基因表达显著降低,这表明建立了稳定的低表达DANCR的前列腺癌细胞系PC3,C4-2B和VCa P。4.与对照组相比,Scramble-Exo处理组的ST2细胞内有明显的较高DANCR表达水平,而低表达DANCR的exosome处理ST2细胞48h后,ST2细胞中DANCR表达水平降低(P<0.001)。三、DANCR介导调节骨髓间质细胞促进前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭1.与对照组比较,exosome中DANCR表达降低后,ST2-CM在不同的时间点可抑制前列腺癌细胞PC3、C2-4B和VCa P细胞的增殖。2.小室转移实验结果提示,在PC3细胞中,与对照组比较,ST2-CM(PC3-scramble-Exo)处理组的穿膜细胞数相比显著增加(P<0.001),但是当DANCR在exosome中表达水平降低后,穿膜细胞数随之减少(P<0.05)。但在C4-2B细胞中,对照组与ST2-CM(PC3-scramble-Exo)处理组的穿膜细胞数相比无显著统计学差异(P>0.05)。3.PC3和VCa P细胞中,对照组ST2-CM(Medium only)穿膜细胞数与ST2-CM(C4-2B-scramble-Exo)处理组的穿膜细胞数相比显著增加(P<0.001)。但当DANCR在exosome中表达水平降低后,穿膜细胞数量随之减少(P<0.05或P<0.001)。但在C4-2B细胞中,对照组与处理组的穿膜细胞数相比无显著统计学差异(P>0.05)。4.小室侵袭实验结果提示,在PC3和C4-2B细胞中,与对照组比较,ST2-CM(C4-2B-scramble-Exo)处理组的穿膜细胞数显著增加(P<0.05或P<0.001)。但当DANCR在exosome中表达水平降低后,穿膜细胞数随之显著减少(P<0.01)。四、Exosome中DANCR通过介导骨基质细胞自噬调节骨微环境1.C4-2B-Exo中DANCR表达水平降低后,经C4-2B-Exo处理的ST2细胞中的LC3-II表达水平降低,且含有自噬小体的细胞与细胞总数占比例也显著降低(P<0.01)。2.Mouse Cytokines&Chemokines Array筛选和q-PCR验证结果显示C4-2B细胞exosome中DANCR表达水平显著降低后,经C4-2B-Exo处理的ST2细胞中的CCL4表达也显著降低(P<0.01)。研究结论:1.lnc RNA-DANCR不仅在前列腺癌细胞来源的exosome中高表达,而且在前列腺细胞系中也存在特异性高表达。此外,前列腺癌患者血清exosome中DANCR的表达水平显著升高。提示DANCR具有作为前列腺癌分子诊断标志物的潜在应用价值。2.证实DANCR可以经exosome途径在癌细胞与骨髓基质细胞之间传递。并且前列腺癌细胞衍生的exosome可被受体ST2细胞摄取并促进前列腺癌细胞PC3的增殖。3.前列腺癌细胞exosome处理后的ST2-CM可以显著影响前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。提示DANCR介导调节骨髓间质细胞促进前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。4.前列腺癌细胞分泌的exosome中DANCR在骨微环境中的作用是通过调节骨髓间质细胞的自噬活性来实现的。本研究表明,前列腺癌细胞exosome中存在异常表达的lnc RNA,其中DANCR不仅在前列腺癌细胞分泌的exosome中异常高表达,也在前列腺癌病人中血清exosome中高表达。Exosome中DANCR可通过调节骨微环境促进前列腺癌的发生和发展,提示Exosomal DANCR具备成为前列腺肿瘤分子诊断标志物的潜能。