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目的： 不论外伤引起的视神经损害还是青光眼导致的视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell, RGC)死亡，结果都是视力的不可恢复性丧失，临床上缺乏有效的救治措施。如何能够诱发和促进损伤RGC的修复和再生，从而达到其功能恢复是我们研究的最终目标。实验发现受损RGC的存活、修复、再生以及功能恢复与其所处微环境中神经营养因子(neurotrophic factors, NFs)含量等因素有关。本文：(1)通过观察SD大鼠视神经夹伤后视网膜上GAP-43(growth associated protein-43)蛋白和基因的表达变化，了解玻璃体腔内注射睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)和腺病毒介导脑源性神经营养因子(adenovirally delivered brain-derived neurotrophic factor, Ad-BDNF)对视神经损伤、修复和再生的作用；(2)通过经上丘注射荧光金(fluoro-gold，FG)逆行标记RGC进行计数，观察SD大鼠视神经夹伤后玻璃体腔内注射CNTF和Ad-BDNF对视神经损伤后RGC存活的作用。 方法： 第一部分：CNTF和Ad-BDNF对视神经夹伤后视网膜生长相关蛋白表达的影响 1．大鼠视神经夹伤模型建立 成年SD大鼠分离暴露视神经，于眼球后2mm处用显微平台镊夹压视神经5秒，制作视神经夹伤模型。 2．实验动物分组 随机挑选成年SD大鼠并分为4组：正 第国牢医大学协士研兔 文一 常对照组、视神经夹伤对照组、CNTF 治疗组和 Ad－BDNF治疗组。 3．玻璃体腔内注射神经营养因子 视神经夹伤后立即在 角巩膜缘后1石mm用微量注射器向大鼠玻璃体腔内分 另注入重组人CNTF50ng（10p）、Ad－BDNF10pL牙 生理盐水 10pL。 4．视网膜取材 分别于夹伤后1、2、3和4周颈椎脱臼处 死动物，完整揭取整个视网膜组织置于－80 oC冰箱中保 存。 5．蛋白电泳和免疫印迹法检查 取一定量大鼠视网膜组 织（湿重 159）冰上匀浆后进行 SDS－PAGE垂直电泳， 将电泳胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜wC膜）上， 用NC膜进行兔疫组织化学显色曝光成像，进行图像分 析。 第h部分：CNTF和Ad－BDNF对视神经夹伤后GAP－43基因表达的影响 1．大鼠视神经夹伤模型建立、实验动物分组和玻璃体腔内 注射CNTF和Ad－BDNF 同第一部分。 2．眼球取材和全视网膜超薄切片 分别于夹伤后1、2、3 和4周颈椎脱臼处死动物，完整摘取眼球置于－80oC冰 箱中保存。全眼球超薄冰冻切片，4％多聚甲醛固定15 分钟后－4oC冰箱保存。 3．原位杂交（in situ hybridization，旧H）SD大鼠全眼 球切片进行GAP43mRNA原位杂交，显微镜下观察对 照。 第三部分：CNTF和Ad－BDNF对视神经夹伤后RGC存活的影响 1．大鼠视神经夹伤模型建立、实验动物分组和玻璃体腔内 注射CNTF和Ad－BDNF 同第一部分。 2．FG逆行标记 RGC 实验动物取材前 7天用 846麻醉剂 一10一WWffeweSlbl－．deNgtbFWgtA6 第口旱医大学修士研鬼生论文一 肌肉注射lmUkg麻醉，通过耳杆固定在立体定位仪上， 根据大鼠脑切片图谱第25层面上丘视区深度，两侧上 丘视区分别注射荧光金 0．15pL，逆行标记 RGC。 3．全视网膜铺片 过量麻醉处死实验动物，在角巩膜缘做 定位标记后取眼球，沿角巩膜缘剪除前节，将全视网膜 花瓣样剪开铺片于载玻片上，用抗荧光封片剂 VeCtashje旧封片，避光－4oC冰箱保存。 4．RGC计数 在BX七0荧光显微镜下进行RGC的观察和 计数，计数观察倍数 400 X。 结果： 1．正常成年SD大鼠视网膜上GAP43呈现低表达，分子 量约为47KD。正常成年SD大鼠视网膜上仅在节细胞 层检测到少数细胞存在GAP－43mRNA杂交信号。经上 丘注射荧光金后7天标记的正常成年SD大鼠视网膜上 RGC数为2155t265个lmmZ（n二12）。 2．视神经夹伤对照组大鼠视神经夹伤后，视网膜上 GAP－43蛋白表达上升，在损伤发生后1周左右蛋白表 达量达到最高峰，在损伤发生后4周左右时其表达量降 低到接近正常水平。视神经夹伤后1周时存在于视网膜 神经节细胞层中的GAP－43mRNA杂交信号表达相对较 强，夹伤后2周时杂交信号减弱基本消失。视神经夹伤 后视网膜上RGC数下降迅速，神经夹伤后1周时下降 到正常值的 61．1％，为 1316t20llmm2；神经夹伤后 2 周时下降到正常值的 26．5％，为 571d28lmm2；3周时 下降到正常值的 20．1％，为 441 f95lmmZ；4周时下降 至正常值的 17．1％，为 369土76lmmZ（n二5）。 3．CNTF治疗组在损伤发生后 2周内视网膜上 GAP．43表