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目的: 不论外伤引起的视神经损害还是青光眼导致的视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell, RGC)死亡,结果都是视力的不可恢复性丧失,临床上缺乏有效的救治措施。如何能够诱发和促进损伤RGC的修复和再生,从而达到其功能恢复是我们研究的最终目标。实验发现受损RGC的存活、修复、再生以及功能恢复与其所处微环境中神经营养因子(neurotrophic factors, NFs)含量等因素有关。本文:(1)通过观察SD大鼠视神经夹伤后视网膜上GAP-43(growth associated protein-43)蛋白和基因的表达变化,了解玻璃体腔内注射睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)和腺病毒介导脑源性神经营养因子(adenovirally delivered brain-derived neurotrophic factor, Ad-BDNF)对视神经损伤、修复和再生的作用;(2)通过经上丘注射荧光金(fluoro-gold,FG)逆行标记RGC进行计数,观察SD大鼠视神经夹伤后玻璃体腔内注射CNTF和Ad-BDNF对视神经损伤后RGC存活的作用。 方法: 第一部分:CNTF和Ad-BDNF对视神经夹伤后视网膜生长相关蛋白表达的影响 1.大鼠视神经夹伤模型建立 成年SD大鼠分离暴露视神经,于眼球后2mm处用显微平台镊夹压视神经5秒,制作视神经夹伤模型。 2.实验动物分组 随机挑选成年SD大鼠并分为4组:正 第国牢医大学协士研兔 文一 常对照组、视神经夹伤对照组、CNTF 治疗组和 Ad-BDNF治疗组。 3.玻璃体腔内注射神经营养因子 视神经夹伤后立即在 角巩膜缘后1石mm用微量注射器向大鼠玻璃体腔内分 另注入重组人CNTF50ng(10p)、Ad-BDNF10pL牙 生理盐水 10pL。 4.视网膜取材 分别于夹伤后1、2、3和4周颈椎脱臼处 死动物,完整揭取整个视网膜组织置于-80 oC冰箱中保 存。 5.蛋白电泳和免疫印迹法检查 取一定量大鼠视网膜组 织(湿重 159)冰上匀浆后进行 SDS-PAGE垂直电泳, 将电泳胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜wC膜)上, 用NC膜进行兔疫组织化学显色曝光成像,进行图像分 析。 第h部分:CNTF和Ad-BDNF对视神经夹伤后GAP-43基因表达的影响 1.大鼠视神经夹伤模型建立、实验动物分组和玻璃体腔内 注射CNTF和Ad-BDNF 同第一部分。 2.眼球取材和全视网膜超薄切片 分别于夹伤后1、2、3 和4周颈椎脱臼处死动物,完整摘取眼球置于-80oC冰 箱中保存。全眼球超薄冰冻切片,4%多聚甲醛固定15 分钟后-4oC冰箱保存。 3.原位杂交(in situ hybridization,旧H)SD大鼠全眼 球切片进行GAP43mRNA原位杂交,显微镜下观察对 照。 第三部分:CNTF和Ad-BDNF对视神经夹伤后RGC存活的影响 1.大鼠视神经夹伤模型建立、实验动物分组和玻璃体腔内 注射CNTF和Ad-BDNF 同第一部分。 2.FG逆行标记 RGC 实验动物取材前 7天用 846麻醉剂 一10一WWffeweSlbl-.deNgtbFWgtA6 第口旱医大学修士研鬼生论文一 肌肉注射lmUkg麻醉,通过耳杆固定在立体定位仪上, 根据大鼠脑切片图谱第25层面上丘视区深度,两侧上 丘视区分别注射荧光金 0.15pL,逆行标记 RGC。 3.全视网膜铺片 过量麻醉处死实验动物,在角巩膜缘做 定位标记后取眼球,沿角巩膜缘剪除前节,将全视网膜 花瓣样剪开铺片于载玻片上,用抗荧光封片剂 VeCtashje旧封片,避光-4oC冰箱保存。 4.RGC计数 在BX七0荧光显微镜下进行RGC的观察和 计数,计数观察倍数 400 X。 结果: 1.正常成年SD大鼠视网膜上GAP43呈现低表达,分子 量约为47KD。正常成年SD大鼠视网膜上仅在节细胞 层检测到少数细胞存在GAP-43mRNA杂交信号。经上 丘注射荧光金后7天标记的正常成年SD大鼠视网膜上 RGC数为2155t265个lmmZ(n二12)。 2.视神经夹伤对照组大鼠视神经夹伤后,视网膜上 GAP-43蛋白表达上升,在损伤发生后1周左右蛋白表 达量达到最高峰,在损伤发生后4周左右时其表达量降 低到接近正常水平。视神经夹伤后1周时存在于视网膜 神经节细胞层中的GAP-43mRNA杂交信号表达相对较 强,夹伤后2周时杂交信号减弱基本消失。视神经夹伤 后视网膜上RGC数下降迅速,神经夹伤后1周时下降 到正常值的 61.1%,为 1316t20llmm2;神经夹伤后 2 周时下降到正常值的 26.5%,为 571d28lmm2;3周时 下降到正常值的 20.1%,为 441 f95lmmZ;4周时下降 至正常值的 17.1%,为 369土76lmmZ(n二5)。 3.CNTF治疗组在损伤发生后 2周内视网膜上 GAP.43表