脂筏是存在于细胞生物膜上的特殊微区,富含胆固醇、鞘脂等脂质,并负载着相关蛋白,如GPI锚定蛋白、小窝蛋白( caveolin)等。它是一种动态结构,漂浮在无序的细胞膜脂质双层中。由于其特殊的生化组成和特性,脂筏被认为是细胞膜上多种生物学活动活跃进行的结构域,其为蛋白质的相互作用提供募集平台,在信号转导、细胞骨架重建等过程中都发挥着重要的作用。TNF-α首先以跨膜的形式(tmTNF-α)表达在细胞表面,经TNF转化酶的作用,被剪切释放出分泌型TNF-α(sTNF-α),两型TNF-α的作用不尽相同。前期工作提示tmTNF-α的-47位半胱氨酸是棕榈酰基化位点,tmTNF-α部分定位在脂筏内,但tmTNF-α介导的胞毒效应与脂筏的关系尚不清楚。此外,TNFR1也有部分定位在脂筏内,sTNF-α与脂筏内外的TNFR1结合,传递的信号是否一致也尚不清楚。为明确两型TNF-α与脂筏的关系,从利用蔗糖密度梯度离心法提取脂筏结构和用脂筏破坏剂破坏完整的脂筏结构两方面入手,研究脂筏在两型TNF-α介导的正向信号中的作用。其主要结果如下:1.破坏靶细胞的脂筏可增强sTNF-α介导的杀伤,却抑制tmTNF-α的胞毒效应:本课题组前期实验中,以脂筏破坏剂MCD破坏HeLa细胞(靶细胞)的脂筏,可显著增强sTNF-α的胞毒效应(p<0.01),却明显抑制tmTNF-α的杀伤作用(p<0.05)。为了进一步说明两型TNF-α作用的变化是脂筏引起的,而不是MCD本身的影响,我们用另一种脂筏破坏剂胆固醇氧化酶(cholesterol oxygen oxidoreductase,ChOx)处理靶细胞,结果显示,靶细胞用胆固醇氧化酶处理后,其效应与MCD一致,脂筏破坏后使sTNF-α的胞毒效应增加约44% (p<0.01),而使tmTNF-α的胞毒下降约30% (p<0.05)。提示脂筏在两型TNF-α的胞毒效应中发挥不同作用,脂筏可促进tmTNF-α对靶细胞的胞毒作用,而抑制sTNF-α的杀伤作用。2.破坏脂筏导致效靶细胞的粘附受抑制,从而阻断tmTNF-α的胞毒作用:用MCD(10mM)破坏HeLa细胞(靶细胞)的脂筏45min后,发现粘附在HeLa细胞上的效应细胞-T24细胞(稳转野生型tmTNF-α,tmTNF-α-pIRES2-EGFP)明显减少,由约100个细胞/视野下降至约30个细胞/视野。提示效靶细胞间粘附下降是导致MCD阻断tmTNF-α的胞毒作用的重要原因之一,即脂筏促进tmTNF-α的胞毒作用的机制之一是通过效靶细胞间的粘附作用。3.破坏脂筏使sTNF-α介导的生存信号通路NF-κB活性下降:观察脂筏破坏前后对sTNF-α介导的生存信号-─NF-κB通路活化的影响。结果发现,经sTNF-α(400ng/ml)作用30min,MCD未处理组与MCD处理组相比较,ELISA检测HeLa细胞的NF-κB活性明显下降,且western blot显示NF-κB的抑制因子ΙκB-α表达增加,胞核中的p65表达水平明显减少。由于NF-κB活化介导生存信号,提示脂筏破坏后,可抑制NF-κB活化介导的生存信号,从而增强sTNF-α的胞毒作用,即脂筏抑制sTNF-α的杀伤作用机制之一是通过促进sTNF-α介导的生存信号NF-κB的活化。4.破坏脂筏使sTNF-α介导的凋亡信号TNFR1内化增加:荧光显微镜结果显示,转染TNFR1和抑制内化突变体Y236A-TNFR1的293T细胞在未刺激下绿色荧光蛋白主要在膜上表达; sTNF-α刺激后,转染TNFR1细胞绿色荧光蛋白在胞浆内有明显聚集和表达,转染Y236A-TNFR1基本仍在膜上表达。提示sTNF-α可以导致TNFR1的内化,Y236A-TNFR1-pEGFP-N1质粒构建成功,可抑制TNFR1的内化功能。sTNF-α作用于TNFR1,既可激活NF-κB通路介导生存信号,也可介导杀伤信号。转染TNFR1组,其sTNF-α的杀伤率明显增加一倍(p<0.01),而转染抑制TNFR1内化的Y236A-TNFR1质粒组,其杀伤率与对照组无差别,仅为19.3% (p<0.01)。提示sTNF-α的胞毒由TNFR1内化介导。为观察脂筏破坏后sTNF-α的胞毒增加是否与TNFR1内化有关,用MCD预处理高表达TNFR1的THP1细胞,再用sTNF-α刺激1h,流式细胞仪检测胞膜表面TNFR1的表达,发现脂筏破坏后,膜上TNFR1表达下降34% (p<0.05),荧光显微镜检测证实了这一结果,sTNF-α作用于转染TNFR1-pEGFP-N1的293T细胞时,脂筏破坏后内化的TNFR1比未破坏组明显增加。而Western Blot结果显示MCD破坏脂筏并不影响细胞内总的TNFR1表达。提示脂筏破坏可使sTNF-α介导的TNFR1的内化增加,结合胞毒实验,进一步提示脂筏破坏后sTNF-α的胞毒增加的另一机制是TNFR1内化增多,从而增强杀伤信号,即脂筏抑制sTNF-α的杀伤作用机制之二是通过减弱杀伤信号,即减少TNFR1的内化。5. sTNF-α和tmTNF-α分别促进生存或死亡分子募集至脂筏内:用sTNF-α和tmTNF-α分别刺激HeLa细胞10min,提取脂筏,进行Western Blot,结果表明:sTNF-α可导致其下游生存信号分子TNFR1、TRADD、RIP和TRAF2向脂筏内聚集,tmTNF-α则可募集凋亡信号分子TNFR1、TRADD、FADD和Caspase-8至脂筏内;而非刺激状态下这些信号分子主要分布在脂筏外。提示sTNF-α以脂筏为平台募集抗凋亡复合物TRADD-RIP-TRAF2,介导抗凋亡信号,抵抗杀伤;而tmTNF-α则以脂筏为平台募集凋亡复合物TRADD-FADD-Caspase-8,传递凋亡信号,介导杀伤。结论:脂筏作为信号转导平台,在两型TNF-α的胞毒效应中发挥不同作用,脂筏可促进tmTNF-α对靶细胞的胞毒作用,其机制为:脂筏参与效靶细胞的粘附,从而促进tmTNF-α对靶细胞的杀伤效应;同时,tmTNF-α在脂筏内可募集凋亡信号TRADD-FADD-Caspase-8,以介导凋亡和杀伤信号。脂筏可抑制sTNF-α的杀伤作用,其机制为:脂筏一方面可使sTNF-α介导的生存信号─NF-κB活化上调,另一方面还可使sTNF-α介导的凋亡信号─TNFR1的内化减少,且sTNF-α以脂筏为平台募集抗凋亡复合物TRADD-RIP-TRAF2,介导抗凋亡信号,从而使靶细胞抵抗杀伤。一.TNFR1及其突变体重组质粒的构建肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor, TNFR)包括TNFR1和TNFR2两型,相对分子量分别为55kD和75kD的蛋白质。TNF-α只有与两型TNFR结合,才能发挥生物学效应。sTNF-α通过TNFR1的胞浆结构域募集不同的信号复合物介导细胞生存或凋亡。tmTNF-α也可以通过TNFR1诱导胞毒效应,由于tmTNF-α是锚定在细胞膜上的II型蛋白,通过细胞与细胞接触介导细胞凋亡,其与TNFR1结合后诱导的凋亡信号途径可能不同于sTNF-α。本项目拟通过TNFR1胞浆段的内化区( internalization domain, TRID, 235-243aa)、中性鞘磷脂酶区(neutral sphingomyelinase domain, NSD, 338-348aa)和死亡结构域(death domain, DD, 356-441aa)三个功能结构域来研究TNFR1介导tmTNF-α凋亡的信号途径。采用RT-PCR法获得TNFR1全长基因,重叠PCR法分别获得抑制内化的Y236A-TNFR1、缺失中性鞘磷脂酶的ΔNSD-TNFR1及缺失死亡结构域的ΔDD-TNFR1基因。然后,将TNFR1全长及突变基因定向克隆到pEGFP-N1载体,为后续细胞生物学提供实验工具。二.pTriEx4.0载体多克隆位点的改造在本课题组的科研工作中,需要将相同的目的基因克隆到不同功能和特点的表达载体上。使用传统的分子生物学方法,每更换一次载体,都要从头构建,需经历PCR扩增,酶切,连接,转化,鉴定和DNA测序的过程。在此过程中PCR引物合成及DNA测序分析耗时较长,且PCR扩增目的片段时,会出现碱基突变和缺失,容易导致分子克隆的失败,这无疑会加大工作量,影响实验顺利进行。为解决这一问题,实现同一的目的基因在不同的表达载体快速切换,本课题组设计了一套载体改造方案。其基本策略是:以pEGFP-N1的多克隆位点(multiple clone site, MCS)替换需改造质粒pTriEx 4.0的原有MCS。因pEGFP-N1的MCS很短,不方便酶切回收的操作,故在其EcoRI处先插入一段238bp的小片段,再用此延长的MCS取代需被改造载体的MCS,将延长的238bp小片段切除后即构建成功。三.Δ115-118-tmTNF-α-pIRES2-EGFP-XhoI突变体的构建肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF-α)是一种作用广泛的细胞因子,主要有单核巨噬细胞产生。TNF-α属于肿瘤坏死因子超家族成员,该家族成员虽然生物学功能各不相同,但是它们蛋白质分子一级结构中的氨基酸序列的46-58、119-130、150-157等区域高度同源(保守结构域);另外它们必须以同源三聚体形式与其相应受体结合才能介导生物学效应。前期工作已证实tmTNF-α三聚体的形成与氨基酸序列中高度保守序列有关,因此,我们进一步推测tmTNF-α保守序列邻近的氨基酸是否也影响TNF-α三聚体的形成,从而影响tmTNF-α的生物学效应。本课题采用重叠PCR方法将119-130保守序列邻近的115-118位氨基酸缺失,并将突变体分别克隆和亚克隆至pcDNA3.0和pIRES2-EGFP-XhoI载体,然后,将Δ115- 118-pIRES2-EGFP-XhoI重组质粒转染293T细胞,做后续细胞生物学实验,为tmTNF-α分子结构和功能关系的深入研究提供线索,对tmTNF-α的基础研究及其临床应用具有重要的理论意义和实用价值。本部分研究实验结果如下:1. TNFR1及突变体重组质粒的构建及鉴定1.1 TNFR1及突变体重组体的构建:以THP1的cDNA为模板,用RT-PCR法获得TNFR1全长基因,用XhoI和BamHI对目的基因和pEGFP-N1载体进行双酶切,并用T4 DNA连接酶连接,将连接产物转化DH5α,通过卡那抗性挑选阳性克隆。以TNFR1- pEGFP-N1为模板,用重叠PCR法获得Y236A-TNFR1-pEGFP-N1、ΔNSD-TNFR1- pEGFP-N1和ΔDD-TNFR1-pEGFP-N1三个突变体。1.2阳性克隆的鉴定:通过菌落PCR及上述限制性内切酶双酶切初步鉴定,筛选出阳性克隆,进一步DNA测序分析,确认除预期突变外,无任何其它点突变,移码及缺失突变。2. pTriEx 4.0载体改造2.1 pEGF-N1/238重组体的构建:以tmTNF-α-pcDNA3.0为模板,PCR扩增238bp的片段,并在此片段两端引入EcoRI酶切位点,对此PCR产物和pEGFP-N1载体同时进行EcoRI单酶切,将酶切产物回收纯化后,经T4DNA连接酶连接,使238bp插入pEGFP-N1载体原有的多克隆位点中,以构建MCS延长238bp片段的pEGFP-N1载体(pEGFP-N1/238),将连接产物转化DH5α感受态细菌,挑选阳性克隆。以菌落PCR初步筛选阳性克隆,并经EcoRI酶切鉴定,结果显示:重组质粒(pEGFP-N1/ 238)经酶切后得到约238bp的目的片段,与预期片段大小一致,表明pEGFP-N1载体多克隆位点的成功延长。2.2 pTriEx 4.0/MCS-238重组体的构建:以pEGFP-N1/ 238为模板,PCR扩增已延长238bp的MCS片段(将其命名为MCS-238),并在MCS-238上下游两端分别引入NcoI和EcoR81I双酶切位点(下游引物还引入His标签)。对PCR产物和pTriEx 4.0载体分别进行双酶切,对酶切回收产物以T4DNA连接酶进行连接,转化DH5α感受态细菌,挑选阳性克隆。筛选结果显示:重组质粒经NcoI和EcoR81I双酶切得到约350bp的目的片断,与所连接的目的基因大小一致,提示pTriEx 4.0/MCS-238重组质粒构建成功,已将pEGFP-N1载体的MCS-238成功置换入pTriEx 4.0载体中。2.3 238bp延长片段的切除和pTriEx 4.0 His-N1重组体的构建:将pTriEx 4.0/ MCS -238重组体中的238bp延长小片段经EcoRI单酶切去除。连接转化后通过菌落PCR进行初步鉴定,经DNA测序分析显示改造后的pTriEx 4.0载体中置入的pEGFP-N1载体MCS基因序列无突变和移码,pTriEx 4.0 His-N1载体构建成功。3. tmTNF-α-pcDNA3.0影响三聚体形成突变体重组质粒的构建及鉴定3.1重组体的构建:以tmTNF-α-pcDNA3.0质粒为模板,用重叠PCR法缺失突变115-118位氨基酸,用BamHI和XhoI对目的基因和pcDNA3.0载体进行双酶切,并用T4 DNA连接酶连接,将连接产物转化DH5α,通过其氨苄抗性挑选阳性克隆。3.2阳性克隆的鉴定:通过菌落PCR及上述限制性内切酶双酶切初步鉴定,筛选出阳性克隆,进一步DNA测序分析,证实点突变获得成功,仅在预计位点发生突变,其余核苷酸序列与野生型TNF-α序列相同。3.3Δ115-118-tmTNF-α-pIRES2-EGFP-XhoI突变体重组质粒的构建及鉴定:将荧光载pIRES2-EGFP-XhoI质粒用Bgl II和XhoI进行顺序酶切,另外将上述突变体重组质粒用BamHI和XhoI进行双酶切,取前者酶切的大片段和后者小片段用T4连接酶连接,再转化入DH5α,通过卡那抗性挑选阳性克隆。以菌落PCR筛选阳性克隆。