癫痫是由脑部神经元高度同步的异常放电而引起的脑功能障碍综合症,癫痫发作可以导致脑高级神经功能受损,主要表现为注意力分散、学习记忆力减退、情感行为异常以及社会适应能力下降等,成为影响癫痫患者生活质量的一个重要因素。但癫痫对认知功能损害的机制还不十分清楚。癫痫与认知功能损害的关系越来越受到人们的广泛关注,并已成为现代癫痫病学研究的热点之一。癫痫后认知功能损害受许多因素的影响如:潜在的神经病理学改变,癫痫发作本身,抗癫痫药物的影响等。目前有证据表明痫性发作和脑部结构的病理改变是导致认知损害的主要因素,但其具体作用机制还不清楚。　　 第一部分戊四氮点燃慢性癫痫大鼠认知功能及海马MAPK信号通路的变化　　 目的:观察不同痫性发作次数对戊四氮点燃慢性癫痫大鼠认知功能的影响,并观察MAPK信号通路在慢性癫痫大鼠海马部位的变化规律,对MAPK在癫痫大鼠认知功能损害中的作用进行初步探讨。　　 方法:7-8周龄清洁级健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为对照组(n=20只)和模型组(PTZ组)(n=90只)。模型组大鼠每天早晨8点-9点腹腔注射0.1％PTZ(35mg/kg),按照Racine分级标准,连续3次Ⅳ-Ⅴ级发作认为动物被完全点燃,继续腹腔注射PTZ以维持点燃效果,根据完全点燃后大鼠癫痫发作次数不同,将动物分为不同亚组:痫性发作1次组、5次组、10次组和14次组。对照组大鼠每天早晨8点-9点腹腔注射生理盐水(3.5ml/kg)。并记录它们的行为。各组大鼠在最后一次癫痫发作24小时后,应用转棒仪进行运动能力的评估,应用Morris水迷宫进行空间学习记忆能力的检测。各组大鼠在行为学测试完毕后,在低温操作台上快速分离海马组织,置于-80度冰箱保存备用。分别用RT-PCR的方法和。Western blot的方法检测海马部位MAPK/ERKmRNA和蛋白水平的变化规律。　　 结论:PTZ点燃慢性癫痫模型能够模拟人类癫痫反复发作的过程及癫痫后相关的行为异常,是研究癫痫后认知损害及其相关机制的理想模型。不同痫性发作次数对大鼠认知功能的损害程度不同,癫痫发作早期认知功能无明显受损。慢性点燃癫痫发作后,脑部ERKmRNA表达存在先下降后上升的动态的变化过程,ERK信号通路可能参与了癫痫后认知功能损害的病理基础。　　 第二部分盐酸美金刚对戊四氮点燃慢性癫痫大鼠认知功能及海马MAPK信号通路的影响　　 目的:本研究采用戊四氮点燃慢性癫痫模型,应用盐酸美金刚进行干预,观察盐酸美金刚对癫痫大鼠认知功能的影响,为筛选改善癫痫相关性认知功能障碍的药物奠定实验基础。并进一步观察美金刚对慢性癫痫大鼠海马部位MAPK信号通路的影响,从分子水平对美金刚的作用机制进行初步探讨。　　 方法:清洁级健康雄性Spmgue-Dawley(SD)大鼠,随机分为正常对照组(n=20只)、美金刚对照组(n=15只)和模型组(PTZ组)(n=50只)。PTZ组大鼠完全点燃后,随机分为癫痫对照组(n=20)和癫痫+美金刚组(n=15)。正常对照组大鼠每天早晨8点-9点腹腔注射生理盐水(3.5ml/kg),共44天。美金刚对照组大鼠每天早晨8点-9点腹腔注射生理盐水(3.5ml/kg),共44天,自第31天起,每日给予生理盐水前15分钟给予腹腔注射盐酸美金刚(10mg/kg),连用14天。癫痫对照组大鼠每天早晨8点-9点腹腔注射0.1％PTZ(35mg/kg),按照Racine分级标准,连续3次Ⅳ-Ⅴ级发作认为动物被完全点燃,继续腹腔注射PTZ以维持点燃效应,共44天。癫痫+美金刚组大鼠每天早晨8点-9点腹腔注射0.1％PTZ(35mg/kg),按照Racine分级标准,连续3次Ⅳ-Ⅴ级发作认为动物被完全点燃,完全点燃后继续腹腔注射PTZ以维持点燃效应,自第31天起,每日注射PTZ前15分钟给予腹腔注射盐酸美金刚(10mg/kg),连用14天。造模成功后,应用转棒实验检测各组大鼠的运动及肢体协调功能,应用Morris水迷宫检测各组大鼠的空间学习能力。各组大鼠在行为学测试完毕后,在低温操作台上快速分离海马组织,置于-80度冰箱保存备用。分别用RT-PCR的方法和Western blot的方法检测海马部位MAPK/ERK mRNA和蛋白水平的变化规律。　　 结论:盐酸美金刚对PTZ点燃癫痫发作导致的认知损害有明显改善作用,但对正常大鼠应用美金刚却可以导致认知功能受损。说明盐酸美金刚能够该改善病理状态下NMDA受体的过度激活,但同时应考虑到它对NMDA受体生理功能的影响。该实验为临床上应用美金刚来改善癫痫患者认知功能,提高其生活质量奠定了理论基础。　　 在慢性癫痫模型中,盐酸美金刚可以增强大鼠海马ERK1/2mRNA的表达,ERK可能参与了美金刚改善认知功能的分子机制。美金刚对癫痫大鼠海马ERK mRNA水平和蛋白水平影响不一致,提示美金刚可能通过其它作用途径改善了认知功能。美金刚在癫痫中的作用机制有待进一步研究。　　 第三部分戊四氮诱导癫痫持续状态大鼠海马MAPK信号通路的变化　　 目的:前两部分研究发现,在PTZ点燃慢性癫痫模型及美金刚干预后,ERK1/2 mRNA表达存在动态变化,但蛋白水平变化无统计学差异。考虑可能和以下因素有关(1):PTZ点燃慢性癫痫模型,在癫痫发作24小时后进行水迷宫检测,认知功能检测要进行5天,所以进行组织学检测时可能错过了ERK蛋白水平变化的最佳时期;(2):因为ERK在学习记忆中发挥重要作用,行为学检测的学习过程可能影响了ERK的表达。所以本部分实验我们旨在观察一次癫痫发作(statusepilepsy)后不同时间点大鼠海马部位ERK及其活性状态的变化规律,对ERK信号系统在PTZ点燃癫痫大鼠发病机制及其对认知功能损害的作用进行初步探讨。　　 方法:7-8周龄清洁级健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为正常对照组(n=28只)和癫痫持续状态组(SE组,n=50只)。一周后进行进行癫痫持续状态模型制备,首先给予大鼠腹腔注射1％PTZ(Sigma公司产品)溶液40mg/kg,10min后注射20mg/kg,然后每10min注射10mg/kg。大鼠惊厥的行为表现采用Racine六级评价标准。诱发成功的大鼠均达标准4～5级,且重复的SE发作达30min以上。造模成功后,各组分别在SE后30min、1h、3h、12h、24h、72小时、7d等时间点取材,采用western blot方法检测海马部位ERK及P-ERK的表达(n=4只)。　　 结论:PTZ点燃癫痫持续状态大鼠海马MAPK(ERK)活性状态呈现动态变化的趋势,说明ERK信号通路在癫痫动物模型中作用复杂,可能起到了双刃剑的作用。本部分实验发现了SE发作后ERK表达的变化规律,为进一步研究ERK在癫痫及其相关的认知功能损害中的作用奠定了基础。　　 第四部分美金刚及尼莫地平对戊四氮诱导癫痫持续状态大鼠海马MAPK信号通路的影响　　 目的:胞浆内钙离子浓度升高可以通过Ras-MAPKK-ERK途径激活ERK信号系统。前期研究发现尼莫平和美金刚可以改善癫痫大鼠的空间学习记忆能力。本部分实验观察尼莫地平和美金刚对PTZ点燃癫痫持续状态大鼠海马MAPK的影响,对二者改善认知功能的机制进行探讨。　　 方法:体重(250±20)g的清洁级健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为4组:正常对照组(normal control,NC)35只、持续癫痫发作组(PTZ)40只和尼莫地平干预组(NMD,2.5 mg/kg)40只、美金刚干预组(MEM,10 mg/kg)40只。SE组和NC组模型的制备同第四部分。NMD组大鼠在PTZ注射前15 min腹腔注射NMD2.5mg/kg。美金刚组大鼠在PTZ注射前15 min腹腔注射美金刚10 mg/kg。每组在SE发作后30min、1h、3h、12h、24h、72h和7d等不同时间点各取4只大鼠,10％水合氯醛腹腔注射麻醉,迅速断头处死,在低温修块台上分离出双侧海马组织,立即放入液氮中,再转移到-80℃冰箱保存。用总蛋白提取液提取总蛋白,用Western blot方法检测各组大鼠海马ERK及P-ERK的表达。　　 结论:L型钙通道阻滞剂尼莫地平能够明显增加癫痫大鼠海马部位P-ERK的表达,而NMDA受体拮抗剂美金刚却使P-ERK表达降低,说明二者的作用途径不同。ERK激活在NMDA受体依赖的学习记忆中起着重要作用,本实验结果提示美金刚改善认知功能的作用机制可能不是通过ERK信号通路实现的,为研究美金刚的作用机制提供了新的研究内容与方向。